高效液相色譜測定明日葉中查爾酮的含量

鄧建梅，余傳波，鄭毅

（攀枝花學院生物與化學工程學院，四川攀枝花617000）

明日葉（Angelica keiskei）也叫明日草、咸草等。最初來源于日本的伊豆島，是傘形科草本植物的一種[1-2]。葉卵圓形，莖多，分枝能力較強，其生命力強盛，根系很發達，能在很多惡劣的環境中存活，具有“今日摘葉，明日長新芽”，故又叫“明日草”，由于自身含有大量的維生素、微量元素等營養物質和查爾酮等活性物質，被譽為“二十一世紀的健康食品”。其中，黃酮類活性物質在明日葉中含量較高，而查爾酮是一種重要的黃酮類化合物，其基本構成是1，3-二苯基丙烯酮[3-6]。有研究表明查爾酮對癌癥和腫瘤具有很強的抑制作用，同時還可以降血糖，降低膽固醇，具有抗血栓，抗菌消炎、防艾滋病等諸多功效[7-8]。在國外，許多國家已經開始大面積種植明日葉，且作為一種健康蔬菜而普遍食用。在中國，明日葉已在臺灣地區被廣泛種植，在云南、江蘇、上海、山東、東北等多個地區也已經被逐漸引進并進行大面積種植。

目前國內有學者用分光光度計對明日葉中查爾酮的提取工藝進行了研究，但具體的工藝參數不夠清楚，另外未見報道用高效液相色譜對其查爾酮進行測定，尤其對高效液相色譜法測定明日葉中查爾酮的色譜條件更沒有學者研究，如能結合現代儀器對其查爾酮進行測定，將是對明日葉進行有效應用的一個新的途徑。本試驗正是采用超聲波輔助提取明日葉中查爾酮，高效液相色譜法測定查爾酮含量，以期為綜合應用明日葉奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

明日葉：干熱河谷特色生物資源開發技術中心；查爾酮（99%）：上海雅吉生物科技有限公司；甲醇：色譜純其他試劑均為分析純。

1200型高效液相色譜儀：安捷倫公司；（KH2200DB）超聲波清洗器：昆山禾創超聲波儀器廠。

1.2 查爾酮測定方法

1.2.1 樣品處理

將明日葉放于托盤中，自然風干72 h，粉碎后，用60目篩篩選并存儲于棕色試劑瓶中密封保存以備用。

準確稱取明日葉干粉樣品0.5 g，放置于100 mL錐形瓶中，參考寧鴻珍等[9]的方法對明日葉查爾酮進行提取，將得到的提取液用真空泵進行抽濾，用3 mL～5 mL乙醇洗滌濾渣2至3次，將所得到的濾液再次抽濾；所得濾液轉移到燒瓶，用旋轉蒸發儀蒸發濃縮，再將濃縮的濾液水浴干燥，便得到了明日葉中查爾酮的粗提取物。

1.2.2 色譜條件的選擇與優化

檢測色譜柱為phenomenex C18柱（5 μm，4.6 mm×150mm），柱溫 30℃，波長為 360nm[10]，流速 0.8mL/min，每次進樣20 μL。為保證查爾酮類化合物能很好的被測定，對流動相進行了優化，以不同濃度的甲醇∶水、甲醇∶0.4%磷酸作為流動相，其比例設置為50∶50、55 ∶45、60 ∶40、65 ∶35、70 ∶30、75 ∶25、80 ∶20、85 ∶15、90∶10。考察標準品的出峰情況。

1.2.3 標準溶液的配制

用甲醇溶解準確稱量好的查爾酮標品20.00 mg，溶解并定容至50 mL，再按梯度配制成10、20、40、80、160、320 μg/mL 的標準溶液[11]。

1.2.4 單因素試驗

稱取約0.5 g明日葉粉末，加入一定濃度的乙醇進行超聲波輔助提取。設置提取時間為10、20、30、40、50 min；料液比為 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）；設置溫度為50、60、70、80、90℃；乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，測定明日葉查爾酮的含量。每組至少3個重復。

1.2.5 正交試驗

正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗設計Table 1 Orthogonal test design

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

通過對流動相的優化操作，實驗表明流動相中甲醇體積分數越高，出峰時間越早，出峰效果更好。并且當流動相為甲醇∶0.4%磷酸為85∶15時，樣品和標準品溶液的色譜圖清晰單一，波峰完全分離且無雜峰拖尾峰。所以流動相選擇甲醇∶0.4%磷酸為85∶15作為流動相為最佳。

2.2 標準曲線的繪制

2.2.1 單因素標準曲線的繪制

參照文獻[9]，測定吸收波長為360 nm的吸光值，得出線性回歸方程：y=0.041 1x+0.051 7，R2=0.998 3，標準曲線如圖1所示。

圖1 查爾酮標準曲線Fig.1 Chalcone standard curve

2.2.2 正交試驗標準曲線的繪制

圖2為查爾酮液相色譜圖，由圖看出其保留時間為3.213 min，用進樣針分別取20 μL不同濃度的標準溶液進樣，繪制出查爾酮標準曲線，線性回歸方程為：y=34.695x+20.776，R2=0.999 7（N=6）。

2.3 精密度試驗

用微量進樣針分別吸取查爾酮320 μg/mL標準品溶液，在此條件下，連續進樣6次，結果表明相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 1.78%，說明

圖2 查爾酮標準品的色譜圖Fig.2 The chromatogram of chalcone standard

此方法精密度較好，結果見表2。

表2 精密度試驗Table 2 The precision test

2.4 穩定性試驗

取同一樣品溶液 21 μL，經過 0、2、4、6、8 h 和 24 h分別進樣，得出RSD為1.1%，表明試液在24 h內基本不變，結果見表3。

表3 穩定性試驗Table 3 The stability test

2.5 重現性試驗

重現性試驗結果，計算得出RSD為1.51%，重現性較好。結果見表4。

2.6 加樣回收率試驗

加樣回收率試驗結果見表5，樣品中查爾酮的平均回收率為97.43%，說明加樣回收率較好。

表4 重現性試驗結果Table 4 The results of reproducible test

表5 回收率試驗Table 5 The recovery experiment

2.7 單因素試驗結果與分析

2.7.1 不同提取時間對提取效果的影響

提取時間對提取效果的影響見圖3。

圖3 提取時間對提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

由圖3可知，當提取時間在10 min～20 min時，測得查爾酮的吸光值隨時間增長而逐漸增大，當提取時間超過20 min時，測得查爾酮的吸光值有明顯下降且不再有大幅度的提高。這可能是因為本實驗采用乙醇溶液作為萃取溶劑，萃取時間增加，溶劑揮發較多，使乙醇溶液濃度下降，使萃取效果降低。而在提取時間為20 min時，查爾酮能較好的被提取出來。故最佳提取時間為20 min。

2.7.2 不同料液比對提取效果的影響

料液比對提取效果的影響見圖4。

由圖4可知，吸光值隨料液比的增大而升高，其中料液比未達到1∶40（g/mL）時，吸光值增長相對較快，但當料液比達到1∶40（g/mL）后，吸光值增長相對緩慢。因為料液比高會使兩相間的濃度差增大，傳質動力也會增大，所以提取效果也會更好。因為過大的料液比，會增加溶劑的使用量且在后面的操作中增加能耗和拉長時間，通過對提取效果、原料消耗和后續處理難度等問題進行分析、平衡，試驗確定以1 ∶40（g/mL）為最佳料液比。

圖4 料液比對提取效果的影響Fig.4 The influence of liquid ratio on extraction effect

2.7.3 不同提取溫度對提取效果的影響

提取溫度對提取效果的影響見圖5。

圖5 提取溫度對提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由圖5可知，提取效果隨溫度增加先升高再降低，當提取溫度為70℃使，此時有最大的吸光度值，所以可得明日葉查爾酮的提取的最佳提取溫度為70℃。因為溫度過低，減慢提取物的溶出和降低傳質速率：溫度過高，會極大的增加能耗，還可能會使提取物分解和揮發，甚至破壞化合物的分子結構。所以可得明日葉查爾酮的提取的最佳提取溫度為70℃。

2.7.4 不同乙醇濃度對提取效果的影響

不同乙醇濃度對提取效果的影響見圖6。

圖6 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on extraction efficiency

由圖6可知，整個過程吸光值呈現先升高后下降的趨勢。開始乙醇濃度升高，溶液極性升高，吸出大量的查爾酮，當乙醇濃度過高時，會使溶液的極性下降，提取物的溶解度隨之下降，導致提取物不能充分溶解出來，另外一些可溶于醇的成分被析出，與查爾酮形成競爭機制，導致提取效果相對較差。

2.8 正交試驗結果與分析

以樣品1號為例，其色譜圖見圖7，其保留時間為3.159 min，與標準品保留時間3.213 min基本對應，證實了查爾酮的存在。其它樣品測定方法與此相同，其實驗結果及數據分析見表6。

圖7 樣品液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of sample

表6 查爾酮最佳提取條件結果Table 6 The optimum extraction conditions of chalcone

對表6數據進行分析，料液組的極差為2.460，乙醇濃度組的極差為2.040，超聲溫度組的極差為1.262，超聲時間組的極差為1.062。從表中可以看出：對查爾酮的含量影響最大的是料液比，超聲時間對明日葉中查爾酮含量的影響最低，乙醇濃度和超聲溫度對查爾酮含量影響不大。通過正交試驗得出，試驗最優組合料液比1∶30、乙醇濃度為80%、超聲溫度為80℃和超聲時間為30 min時。為了驗證明日草黃酮最佳提取工藝的可靠性，在最優條件下，料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度為80%、超聲溫度為80℃和超聲時間為30 min做3次平行試驗，結果取算數平均值，其結果見表7。

表7 驗證性試驗Table.7 The replication experiment

穩定性試驗結果表明，查爾酮含量平均值為22.675 mg/g，相對標準偏差0.98%此偏差與偏離算術平均值的程度均在2.0%以內，考慮試驗誤差，表明該提取工藝參數較為穩定。因此，采用正交試驗得到的查爾酮提取工藝最優條件的數據可靠。

3 結論

1）在查爾酮的提取過程中，質量/體積對查爾酮提取率的影響最為顯著，乙醇濃度對提取率影響較大，其次是提取溫度，提取時間幾乎對查爾酮提取沒有影響。最佳組合條件為：在料液比為1∶30（g/mL）、提取溫度為80℃、乙醇濃度為80%和提取時間為30 min時，得到最高的查爾酮含量：為22.765 mg/g。這比陳欣華等[12]研究提出的查爾酮含量7.53 mg/g要高出兩倍多，這可能是采用現代高端儀器-高效液相色譜測量，減少了試驗誤差，使得含量相對較高。

2）本試驗表明，明日葉查爾酮的含量可通過現代儀器-高效液相色譜法測定，為查爾酮類化合物的獲得提供一種可利用資源，同時也為合理開發明日葉的藥用成分提供一定的依據。但本試驗只是對其查爾酮含量進行了測定，對提取的查爾酮沒有做進一步的研究，在后續的試驗中可以就其生理生化性質等方面進行研究。

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