翅果油亞微乳的制備及其抗疲勞活性研究

王曉敏，白冰，李娟，張凱，謝茵，荀波娜，畢小平，*

（1.山西醫科大學藥學院，山西太原030001；2.山西醫科大學第一醫院神經內科，山西太原030001；3.山西琪爾康翅果生物制品有限公司，山西太原030001；4.山西大醫院，山西太原030001）

翅果油是以翅果經超臨界流方法萃取的一種無溶劑殘留的綠色、營養豐富的植物油。含有棕擱酸、油酸、亞油酸、亞麻酸4種主要的脂肪酸，且油酸與亞油酸含量比例適合人體的需要模式，具有“天然母乳”美稱。此外，它還含有多種人體必需但是須從外界攝取的氨基酸，尤其是維生素E的量居各種油料之冠。研究表明，翅果油具有預防動脈粥樣硬化、抗氧化、降血脂、肝細胞再生，促進大腦神經細胞發育，改善免疫功能、改善睡眠、延緩機體衰老等重要保健作用[1-4]。但到目前為止，對其抗疲勞機制的研究卻鮮有報道。隨著醫藥工業的快速發展，應用于醫藥研究的新制劑技術應運而生[5]。亞微乳（submicro emulsion）即以油相、水相和乳化劑制成的粒徑為0.1 μm～1 μm的新型乳劑，可供靜脈注射，具有安全性好，給藥方便，無刺激性，利用度高等優點，臨床上廣泛用作胃腸外給藥載體[6]：而且，亞微乳還可作為新型靶向制劑，選擇性作用于病變部位，治療效果顯著[7]。結合亞微乳劑型和翅果油的優勢，通過將亞微乳作為藥物載體，旨在制備出一種口感好，生物利用度高，吸收好，安全穩定，刺激性小的新型口服乳劑。

疲勞是反應在生理和心理上的一種復雜的機體狀態，也是人體適應內外環境刺激的自身防御機制，即機體不能維持預定運動強度致使體力和運動耐力下降的一種生理反應[8]。中醫認為，疲勞人群常常呈現為亞健康狀態，這種狀態下人心理焦慮不安，各項機能明顯減退，嚴重時甚至會出現器質性病變[9-10]。據報道，我國每年有60%～70%的人群處于疲勞的亞健康狀態，市場對緩解運動性疲勞產品的需求很大。因此，對緩解體力疲勞的功能性食品的研究與開發，以及從天然植物資源中提取抗疲勞活性成分意義重大。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

翅果油：山西琪爾康翅果生物制品有限公司；聚甘油脂肪酸酯、硬脂酰乳酸鈉、檸檬酸脂肪酸脂：河南奧尼斯特食品有限公司；單硬酯酸甘油酯、蔗糖脂肪酸甘油酯：鄭州市食代添驕化工產品有限公司；卵磷脂：鄭州四維生物科技有限公司；食用甘油：鄭州特正商貿有限公司；山梨酸鉀：浙江保圣科技有限公司；全血乳酸（blood lactic acid，BLA）檢測試劑盒、血清尿素氮（serum urea nitrogen，BUN）檢測試劑盒、肝糖原（hepatic glycogen，LG）檢測試劑盒：上海優選生物科技有限公司；實驗動物（ICR小鼠）：山西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（晉）2015-0001。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；磁力加熱攪拌器79-1：常州市華普達教學儀器有限公司；Z326K高速冷凍離心機：德國科學儀器有限公司；MP3002電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；馬爾文粒徑儀（Nano-Zs90）、Mulitiskam 酶標儀：賽默飛世爾科技有限公司；Vortex-5渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；離心機：賽默飛世爾科技有限公司；超低溫冰箱：賽默飛世爾科技有限公司；數顯恒溫水浴鍋：上海艾牧生物科技有限公司；電動玻璃勻漿機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 翅果油亞微乳的制備

2.1.1 工藝流程

2.1.1.1 O相的制備

按照處方量將卵磷脂，單硬脂酸甘油酯溶于翅果油→不斷攪拌，70℃水浴加熱→為O相。

2.1.1.2 W相的制備

按處方量將聚甘油脂肪酸酯、食品級甘油溶于蒸餾水中→不斷攪拌，70℃水浴加熱→為W相。

2.1.1.3 乳劑的制備

將W相緩緩加入至O相中，保持兩相溫度相同→70℃浴加熱，持續攪拌→加水至全量，形成果油亞微乳初乳→高壓均質機對初乳進行高壓均質→制備成粒度均勻的翅果油亞微乳。

2.1.2 評價指標

外觀、離心試驗、離心穩定性系數Ke值、粒徑及ζ電位等作為主要評價指標。對制備出的翅果油亞微乳進行質量評價。

2.1.3 翅果油亞微乳的單因素試驗

考察乳化劑的類型及用量符合GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》的乳化劑，助乳化劑的類型及用量：對乳化劑和助乳化劑的組成比進行篩選（乳化劑/助乳化劑質量比為 4∶1、3∶1、2 ∶1及1∶1）；防腐劑類型的篩選（山梨酸鉀、苯甲酸鈉及尼泊金酯類）；乳化溫度（50、60、70、80℃）；乳化方法（干膠法、濕膠法、混合法）等各個因素對翅果油亞微乳的質量的影響，確定翅果油亞微乳的處方組成。

2.1.4 翅果油亞微乳的工藝優化

以“2.1.2”項下的指標為依據，采用正交方案設計優化處方及工藝，選擇對配制乳劑有較大影響的4因素為指標，即乳化溫度、攪拌時間、乳化方法、轉速，每個因素又選擇3個水平，采用L9（34）正交試驗設計。極差分析，確定其最優處方。對初乳高壓均質條件即均質壓力、均質次數進行考察。

2.2 動物分組與灌胃

選擇小鼠100只，雌性，體重在18 g～22 g之間，適應性喂養3 d，自由攝食與飲水，12 h光照/黑暗交替飼養。對小鼠進行游泳篩選，剔除不會游泳的小鼠后，將100只小鼠隨機分為陰性對照組與翅果油低、中、高劑量組及亞微乳組，分別灌胃給予蒸餾水，1.25、2.5、5 mL/kg體重的翅果油及23.7 mL/kg體重（相當于低劑量組載油量）的翅果油亞微乳。

2.3 抗疲勞試驗

2.3.1 小鼠負重游泳試驗和力竭游泳時間測定

按照2.2項下，將100只小鼠隨機分為陰性對照組與翅果油低、中、高劑量組及亞微乳組，陰性對照組灌胃給予蒸餾水，試驗組分別灌胃給予翅果油低（1.25 mL/kg）、中（2.5 mL/kg）、高（5 mL/kg）劑量及亞微乳組（23.7 mL/kg），每組10只。對各試驗組小鼠連續灌胃30 d，且隔天游泳訓練1次，每次20 min～30 min，末次灌胃30 min后，小鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮，放入大小約（50 cm×50 cm×40 cm）的游泳箱中游泳，水深不少于30 cm，水溫（25±0.5）℃，進行負重游泳試驗，觀察并記錄各試驗組小鼠從游泳開始至頭部沉入水中10 s仍不能返回水面的時間，作為小鼠的力竭游泳時間。并與陰性對照組進行比較，計算其負重游泳時間的延長率[11]。

2.3.2 全血乳酸（BLA）的含量測定及清除率計算

末次灌胃30 min后，將小鼠置于游泳箱（T=30℃）中不負重游泳60 min后將小鼠取出，并迅速擦干。分為2組，其中一組立即摘眼球取血后脫臼處死。將血液置于抗凝管中，離心取血清待測。根據試劑盒要求測定BLA的含量；另一組小鼠泳后置于安靜環境中休息60 min后，采用相同的方法測定BLA含量，并計算其清除速率[12]。

計算公式為：

式中：v代表清除速率，mmol/（L·min）；c0代表泳后0 min被測指標的濃度，mmol/L；ct代表泳后t時刻被測指標的濃度，mmol/L；t代表清除時間，min。

2.3.3 血清尿素氮（BUN）的含量測定

小鼠末次灌胃30 min后，將小鼠置于游泳箱（T=30℃）中不負重游泳60 min后將小鼠取出，并迅速擦干。分為2組，其中一組立即摘眼球取血后脫臼處死。將血液置于抗凝管中，離心取血清待測，另一組小鼠泳后置于安靜環境中休息60 min后，根據試劑盒操作說明測定各試驗組小鼠BUN的含量，并計算其清除速率v1。

2.3.4 肝糖原（LG）的測定

末次灌胃30 min后，使小鼠在溫度30℃的水箱中不負重游泳60 min，將小鼠取出擦干，分為2組，一組立即脫臼處死取材。在冰板上迅速取小鼠的肝臟組織，用冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，放入液氮中速凍后，取出凍存于-80℃的冰箱中，待測[13]。另一組小鼠泳后置于安靜環境中休息60 min后同法取樣。按照試劑盒要求的方法測定LG的含量，計算小鼠泳后不同時刻的肝糖原相對儲備量。

2.3.5 數據分析

用SPSS17.0統計軟件對試驗結果進行統計分析。采用單因素方差分析進行均值比較。若方差齊，各組間兩兩比較用LSD法：方差不齊，各組間兩兩比較采用Tamhane法。計量資料數據結果以x±s表示，P＜0.05具有統計學差異，P＞0.05表示結果無統計學差異。

3 結果與分析

3.1 翅果油亞微乳的處方篩選結果

3.1.1 單因素試驗結果

翅果油亞微乳的油相為翅果油、表面活性劑為單硬脂酸甘油酯，聚甘油脂肪酸酯，卵磷脂的復配乳化劑、助表面活性劑為食品級甘油。處方組成為Km=1∶1，表面活性劑/助表面活性劑∶翅果油質量比為4∶5，即混合乳化劑為4%、翅果油5%、甘油為4%，蒸餾水為76%，山梨酸鉀為1%，蔗糖為10%。

3.1.2 正交試驗結果

翅果油亞微乳正交直觀分析結果見表1。

表1 翅果油亞微乳正交直觀分析結果Table 1 Results of the elaeagnus mollis oil submicron-emulsion orthogonal test

Ke值表示離心穩定系數，Ke值越小，表明乳劑越穩定。由表1的極差分析可知，各因素對該處方翅果油亞微乳制備的影響大小順序為：B＞C＞D＞A：即影響因素依次為：攪拌速度＞溫度＞乳化方法＞攪拌時間：各因素以K值最優的制備工藝為A3B2C3D1，按照最優處方制備的翅果油亞微乳的Ke值為0.156，實驗方案5的Ke值為0.12，試驗結果表明，按照試驗5制備的亞微乳更加穩定。因此，綜合考慮后制備工藝確定為A3B2C3D1。即以干膠法，在70℃水浴、1 500 r/min轉速條件下，攪拌40 min制備得到初乳。

3.1.3 高壓乳勻的工藝優化結果

考察高壓均質機的均質次數和壓力對翅果油亞微乳的影響結果見圖1。

由圖1A顯示，Ke值隨均質次數的增加，呈先抑后揚之勢，當均質6次時，Ke值最小，圖1B顯示，粒徑隨均質次數的增加而降低。綜合考慮均質次數對Ke值、粒徑的影響，均質6次為宜：圖1C顯示，Ke值隨均質壓力的增加而降低，圖1D亦顯示，粒徑隨均質壓力的增加而降低，當壓力達600×105Pa時，粒徑降低減緩，故均質壓力600×105Pa為宜。

圖1 考察高壓均質機的均質次數和壓力對翅果油亞微乳的影響Fig.1 The homogenization times and pressure of high pressure homogenizer were investigated for the effect of elaeagnus mollis oil submicron-emulsion

3.2 翅果油及其亞微乳對小鼠體重增重的影響

灌胃30天后，采用SPSS17.0統計軟件對各試驗組小鼠的體重進行分析。結果見表2。

由表2可知，試驗前小鼠的初始體重，各試驗組間差異均無統計學意義（P＞0.05），表明動物的初始體重在各組間較為均衡，以后每周及試驗末期各組間小鼠體重差異均無統計學意義（P＞0.05），表明翅果油各劑量組、翅果油亞微乳組、蒸餾水灌胃對小鼠體重增長無影響。

表2 翅果油及其亞微乳對小鼠增重的影響（n=20）Table 2 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on the body weight in mice（n=20）

3.3 翅果油及其亞微乳對小鼠力竭游泳時間的影響

負重游泳時間可以反映小鼠運動耐力，能夠描述運動疲勞的程度。采用SPSS17.0統計軟件，對不同組別小鼠的游泳力竭時間及平均延長率數據進行分析。結果見表3。

表3 翅果油及其亞微乳對小鼠負重游泳時間及平均延長率的影響（n=10）Table 3 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on the time of load swimming in mice（n=10）

由表3可知，翅果油中劑量組小鼠，平均負重游泳時間比對照組延長32%，組間具有統計學差異（P＜0.05）：高、低劑量組與陰性對照組相比無統計學差異（P＞0.05）。數據表明翅果油發揮緩解疲勞作用與劑量相關，且中劑量組具有一定的緩解運動體力疲勞之作用。翅果油亞微乳試驗組與陰性對照組比較，結果雖不具統計學意義，但結果均高于低、高劑量組和陰性對照組，表明將其制備成亞微乳后可增強吸收，有利于提高其生物利用度，有益于延長游泳時間，表現出一定的緩解體力疲勞之功效。

3.4 小鼠運動后生化指標的測定結果

3.4.1 小鼠運動后BUN的測定結果

采用SPSS17.0統計軟件，對不同組別小鼠游泳后即刻（0 min）、游泳后休息60分鐘后，血清尿素氮的含量及清除速率測定結果，進行分析。結果見表4。

表4 翅果油及其亞微乳對小鼠BUN含量和清除速率測定結果（n=10）Table 4 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on blood BUN content in mice（n=10）

表4可知：中劑量組小鼠泳后60 min時的BUN含量比對照組顯著降低，BUN清除速率是對照組的13.2倍，具有統計學差異（P＜0.05）；高、低劑量組的BUN的含量與對照組相比，清除速率分別為對照組的1.8倍和2.1倍，但均無統計學差異（P＞0.05）。亞微乳組與對照組相比，清除率均略高于低、高劑量組和對照組（P＞0.05），表明將其制備成亞微乳后可增強其吸收。數據表明，翅果油及其亞微乳能夠降低小鼠持續高強度運動后體內產生的BUN含量，清除BUN的積累，有助于提升運動能力。

3.4.2 小鼠運動后BLA的測定結果

采用SPSS17.0統計軟件，對各試驗組小鼠游泳后不同時刻血乳酸的含量測定結果及清除速率，進行分析。分析結果見表5。

由表5分析結果可知：翅果油中劑量組的小鼠，血乳酸的清除速率是對照組的5.5倍，顯著高于對照組，具有統計學差異（P＜0.01）；高、低劑量組的清除速率分別是 0.5倍、1.6倍，無統計學差異（P＞0.05）：亞微乳組與對照組相比，無統計學差異（P＞0.05），但清除率均略高于低、高劑量組和對照組，表明將其制備成亞微乳后可增強其吸收。結果表明小鼠體內代謝產物乳酸的消除與翅果油的劑量相關。且中劑量組對乳酸的消除具有高表達。

表5 翅果油及其亞微乳對小鼠BLA含量和清除率測定結果（n=10）Table 5 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on blood LA content in mice（n=10）

3.4.3 小鼠運動后LG的測定結果

依據SPSS17.0統計軟件，對不同組別小鼠的肝糖原的含量結果進行分析。結果見表6。

表6 翅果油及其亞微乳對小鼠游泳后肝糖原含量的影響（n=10）Table 6 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on hepatic glycogen content in mice（n=10）

由表6結果看出，與對照組比較，翅果油中劑量組小鼠泳后0 min和泳后休息60 min時，肝糖原的含量分別相對增加36.3%、35.6%，明顯高于對照組，具有統計學差異（P＜0.05）；高、低劑量組的肝糖原的含量無統計學差異（P＞0.05）；亞微乳組與對照組相比，LG相對增加量均略高于翅果油低、高劑量組（P＞0.05），表明將其制備成亞微乳后可增強其吸收，提高其生物利用度。結果表明：適量的翅果油通過提高肝糖原的儲備，抑制能量消耗，從而具有增進體能和緩解體力疲勞的作用。

4 討論與結論

基于單因素試驗和正交試驗設計成功制備出翅果油亞微乳。該劑型不僅可以掩蓋翅果油本身滋膩礙胃的口感和油樣氣味，還具有吸收效果好、口感好、生物利用度高、安全性和靶向性等作用。同時，亞微乳在正常組織中的分布很少，明顯減輕藥物的不良反應及毒副作用，進而達到高效低毒的特點。這種新劑型為翅果油的進一步開發利用提供了很好的契機，具有一定的市場應用前景。

通過建立小鼠力竭游泳試驗模型，并結合肝糖原、乳酸、血清尿素氮等生化指標，研究翅果油及實驗室自制亞微乳緩解運動性疲勞的影響。根據《保健食品檢驗與評價技術》中規定，若1項以上（含1項）運動試驗和2項以上（含2項）生化指標為陽性，即可以判斷受試物具有緩解體力疲勞的作用。試驗結果顯示，中劑量翅果油可以顯著地延長小鼠負重游泳的時間；增加小鼠肝糖原的儲備量，降低劇烈體力勞動后糖原的消耗；對小鼠運動后血清尿素氮的積累具有明顯的抑制及清除作用；對小鼠運動后血乳酸具有明顯清除作用。我們的研究中由于翅果油亞微乳的載油量為5%（相當于翅果油低劑量組載油量），且小鼠的灌胃容量有限，導致亞微乳無法達到和翅果油中、高劑量相同載油量的灌胃體積。但翅果油亞微乳各項指標均優于翅果油低、高劑量組和陰性對照組，表明將其制備成亞微乳后，可以增加其吸收，提高其生物利用度。

肝糖原是機體重要的能源物質。劇烈運動后葡萄糖耗盡，肝糖原隨之分解入血，補充機體能量所需并維持血糖恒定[1]。若肝糖原耗竭，機體供能不足，就會產生疲勞[14]。所以增加肝糖原儲備，有利于延緩疲勞發生。本文結果表明，翅果油可能是通過提高運動后小鼠肝糖原的儲備，為機體提供更多的運動耐力能量來發揮抗疲勞作用。乳酸是機體通過葡萄糖的無氧糖酵解產生的代謝終產物[15]。劇烈運動時，機體以無氧呼吸為主，其代謝產物乳酸會破壞酸堿平衡，使水鹽代謝紊亂，進而引起疲勞[13]。乳酸積聚越多，疲勞感越嚴重，乳酸清除越徹底，疲勞恢復越快[16]。研究結果表明，翅果油可能是通過加速運動后小鼠血乳酸的清除，有利于其疲勞的恢復，從而緩解其疲勞感。血尿素氮是評價機體運動能力、負荷能力較為靈敏的重要指標[17]。機體高強度運動后，糖與脂肪的分解代謝，不足以提供足夠的能量時，蛋白質會分解，其代謝產物為尿素氮，它含量越高，表明疲勞越嚴重。本試驗結果表明，翅果油可能是通過抑制蛋白質的分解，減少運動后小鼠血清尿素氮的積累，增強運動耐力從而緩解疲勞作用。

本文對翅果油及其亞微乳緩解運動性疲勞及機制進行了初步探討，然而，翅果油中功效成分復雜多樣，富含不飽和脂肪酸、維生素E、植物甾醇和蛋白質等，但其抗疲勞作用究竟是單一組分還是多種化合物的綜合作用結果有待于進一步研究。

本文制備出了一種安全性好，口感俱佳的翅果油亞微乳。該翅果油能顯著延長小鼠負重游泳時間，同時降低小鼠運動后血乳酸、血清尿素氮的蓄積，提高肝糖原的儲備，具有一定的緩解運動性疲勞作用。本研究對于翅果油進一步研發新型的功能產品提供一種新的思路，具有一定的實際應用價值及應用前景。

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