新型納米晶體銀鋅敷料對大鼠深Ⅱ度燙傷感染創面的療效

郇科 白博 白曉智 蘇菲 陳瀟 桑宏勛

[摘要] 目的 研究新型納米晶體銀鋅敷料對深Ⅱ度燙傷感染創面的治療效果。 方法 90只SD雄性大鼠，按隨機數字法分為3組，每組各30只。在大鼠背部建立兩個面積和深度一致的銅綠假單胞菌感染的深Ⅱ度燙傷創面。換藥時A組采用納米銀敷料，B組采用納米晶體銀鋅敷料，C組采用普通無菌敷料。傷后第3、6、10、14天，用ELISA法檢測組織白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）的濃度，用免疫組化染色法觀察B組炎性因子表達情況，并記錄各組創面的愈合時間。 結果 傷后第3、6、10、14天，B組大鼠炎性因子IL-1、TNF-α濃度低于A組及C組，隨著時間延長呈下降趨勢，差異有統計學意義（P < 0.05）。B組IL-10、TGF-β濃度高于A組及C組，隨著時間延長呈上升趨勢，差異有統計學意義（P < 0.05）。免疫組化染色可見隨著治療時間的延長，B組炎性因子TNF-α表達逐漸減少，IL-10表達逐漸增加。B組大鼠的創面愈合時間短于A組和C組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 新型納米晶體銀鋅敷料在對深Ⅱ度燙傷感染創面有較好的抗感染、促愈合效果。

[關鍵詞] 感染創面；炎性因子；抗感染；促愈合；生物活性敷料

[中圖分類號] R644 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（c）-0004-04

[Abstract] Objective To study the therapeutic effect of the new nanocrystalline silver-zinc dressing on deep partial-thickness scald burn infection. Methods 90 male SD rats were divided into three groups by random number table， with 30 rats in each group. Two deep partial-thickness scald wounds infected with Pseudomonas aeruginosa were established in the back of rats with consistent area and depth. Group A was treated with nano-silver dressing， group B was treated with nanocrystalline silver-zinc dressing， and group C was treated with ordinary sterile dressings when dressing change. The concentrations of interleukin -1 （IL-1）， tumor necrosis factor alpha （TNF-α）， interleukin -10 （IL-10） and transforming growth factor beta （TGF-β） in the tissues were detected by ELISA at 3， 6， 10 and 14 days after injury. Immunohistochemistry staining was used to observe the expression of inflammatory cytokines in group B， and the wound healing time of each group was recorded. Results At 3， 6， 10 and 14 days after injury， the levels of inflammatory factors IL-1 and TNF-α in group B were lower than those in group A and C， and the trend decreased with time prolonged， with statistically significant difference （P < 0.05）. The concentration of IL-10 and TGF-β in group B was higher than those in group A and C， and the trend increased with time prolonged， with statistically significant difference （P < 0.05）. Immunohistochemical staining was showed that the expression of inflammatory factor TNF-α in group B decreased with the prolongation of treatment time， and the expression of IL-10 increased gradually. The wound healing time of group B was shorter than those of group A and C， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion The new nanocrystalline silver-zinc dressing has a better anti-infection and healing effect on deep partial-thickness scald burn infection.

[Key words] Infection wounds； Inflammatory factors； Anti-infection； Promote healing； Bioactive dressings

燙傷已成為目前意外損傷的常見損傷之一，嚴重的燙傷機體創傷應激、抵抗力下降，皮膚屏障損傷，局部和全身的免疫反應抑制是導致感染并發癥的主要原因[1]，銅綠假單胞菌是燙傷創面感染最常見的致病菌之一[2-3]。目前創面治療的關鍵在于預防和治療創面感染，促進創面愈合[4-5]。傷后全身應用抗生素在創面局部很難達到有效血藥濃度，為了預防和治療創面感染，局部應用抗菌藥物已成為首選治療方法，面對多種可供選擇的抗菌敷料和制劑，目前尚無統一的標準[6-7]。本研究在納米晶體銀基礎上增加了納米晶體鋅的抗菌促愈合敷料，這是一種新型的復合生物活性敷料；通過研究新型納米晶體銀鋅生物活性敷料、納米銀敷料及普通敷料對SD大鼠深Ⅱ度燙傷感染創面的治療效果，比較炎性因子水平以及傷口愈合時間，為新型抗感染促愈合敷料的應用推廣提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及主要材料、儀器來源

選取實驗用SD雄性大鼠90只，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（軍）2012-0007]，體質量為230～250 g，健康狀況良好，常規條件下單獨飼養。銅綠假單胞菌ATCC 27853由空軍醫大學西京醫院檢驗科提供。旋轉切片機購自德國LEICA公司，CX31顯微鏡及攝像系統購自日本Olympus公司。炎性因子白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購自Raybiotech公司，免疫組化TNFα、IL-10抗體試劑購自Abcam公司。納米銀敷料及納米晶體銀鋅敷料由北京華鉭公司提供。

1.2 制作深Ⅱ度燙傷感染模型及分組

90只大鼠采用乙醚麻醉，在背部兩側用模具、蒸汽燙傷建立兩個直徑約3 cm的圓形創面，燙傷時間8 s，于傷后24 h皮膚全層病理切片HE染色證實為深Ⅱ度燙傷（表皮細胞核固縮，真皮深層受損，膠原纖維融合，毛囊殘留），待創面冷卻后在每個創面接種0.3 mL濃度為1×109 CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液，然后動物回籠單籠飼養，燙傷感染創面制作完成。將所有大鼠按隨機數字表法分為A、B、C組，每組各30只大鼠，常規條件下單籠飼養。A組創面采用納米銀敷料換藥，B組創面采用納米晶體銀鋅敷料換藥，C組采用普通無菌敷料換藥，敷料與創面邊緣皮膚縫合固定，每3天創面消毒，更換敷料1次。

1.3 評價指標

1.3.1 三組大鼠分別于傷后第3、6、10、14天乙醚麻醉，取創面中央組織1 cm2充分勻漿后，3000 r/min（離心半徑8 cm）離心15 min，取上清液200 μL，保存過程中如出現沉淀則再次離心。嚴格按ELISA試劑盒說明書要求檢測炎性因子IL-1、TNFα、IL-10、TGF-β濃度。

1.3.2 免疫組織化學（IHC）染色觀察B組大鼠創面組織TNFα、IL-10炎性因子在第3、6、10、14天的表達情況。TNFα陽性反應結果表現為細胞胞漿內呈棕黃色染色，不著色為陰性。IL-10陽性反應結果表現為細胞胞漿內呈棕褐色染色，不著色為陰性。

1.3.3最后以創面上皮化為愈合標準，創面上皮化率>95%認為創面愈合，分別記錄三組大鼠創面愈合時間。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察

傷后1～3 d大鼠創面炎性滲出較多。換藥后第3天，B組及A組創面干燥，無滲出；C組創面分泌物多，滲出明顯（圖1）。大鼠精神狀態一般，活動略減少，進食一般。1周后大鼠精神狀態基本正常，活動及進食狀況良好。

2.2 三組各時間點炎性因子濃度比較

大鼠燙傷后隨著換藥次數的增加及時間的延長， IL-1、TNF-α在創傷、炎癥發展過程中濃度變化呈逐漸下降趨勢，IL-10、TGF-β濃度變化呈逐漸上升趨勢。傷后第3、6、10、14天，B組IL-1、TNF-α濃度低于A組及C組，IL-10、TGF-β濃度高于A組及C組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 免疫組織化學染色結果

B組免疫組化染色明顯可見隨著換藥次數的增加，治療時間的延長，TNF-α表達逐漸減少，而IL-10表達逐漸增加。見圖3、4（封三）。

2.4 三組大鼠創面愈合時間比較

A、B、C三組創面愈合時間分別為（18.38±1.69）、（16.5±1.2）、（20.63±2.56）d。B組大鼠的創面愈合時間短于A組和C組，差異有統計學意義（P < 0.05）。

3討論

燙傷后皮膚失去細菌屏障作用，極易引起感染，創面感染的預防和治療是提髙燙傷治愈率的關鍵，目前創面的局部抗感染治療是創面治療的重點[8]。銀的抗菌作用歷史悠久，在抗生素發明之前，銀在醫學上一直有諸多應用[9]。近十幾年來，銀在燒燙傷、開放性損傷、慢性潰瘍等感染創面的治療方面發揮著重要作用。銀離子與微生物內含巰基的酶和蛋白質結合而影響其生理功能，破壞細菌多種重要的膜結構，與DNA結合后阻滯其轉錄等諸多方面[10-11]。

研究表明，多種含銀敷料與納米銀敷料對比研究發現，納米銀敷料在殺菌效果方面較其它敷料更好[12-13]，而納米晶體銀釋放的團簇銀不同于普通的銀離子，因其被氯離子或其他有機物質滅活的速率大大降低，因而不易失活[14-15]。納米銀離子敷料對燙傷耐藥菌株具有較好的抗菌效果[16-17]。本實驗所采用的新型納米晶體銀鋅敷料中所含的團簇銀的不斷釋放穩定的、有效濃度的活性銀，具有更為持久的抗菌能力。

鋅是人體必須的微量元素，是許多轉錄因子和酶的協同因子。在促進創面愈合方面，鋅的作用已經得到了廣泛認識和應用[18-19]。目前臨床上應用的主要有含氧化鋅（10%～20%）的膏劑以及少部分含鋅敷料在局部創面的應用。鋅離子通過基質金屬蛋白酶的作用加強對壞死組織的清除，促進角質形成細胞的遷移，加速上皮化和組織修復。本實驗所采用的新型納米晶體銀鋅敷料銀離子發揮抗菌作用的同時，引入鋅離子促進創面愈合，同時，納米鋅在體內外研究中對多種細菌可產生明顯的抑制作用，因此新型生物活性敷料具有抗菌、抗炎、促進組織修復等多種活性功能[19]。

創面的愈合過程伴隨炎性反應動態變化過程。炎性因子的濃度高低變化在殺滅感染的病原菌及促進愈合方面發揮著重要作用。創面的炎性反應過程表現在炎癥細胞的浸潤及炎性因子的釋放，IL-1、TNF-α作為重要促炎因子，在創傷、炎癥發展過程中呈逐漸下降趨勢[20-21]。TNF-α是創傷、感染后機體最早產生的多功能細胞因子之一，由活化的單核巨噬細胞合成分泌，啟動炎性反應炎性因子網絡，并可刺激單核巨噬細胞合成和分泌IL-1、IL-8等炎癥介質，并能協同擴大其生物學效應。IL-10、TGF-β作為重要的抑炎因子，在創傷感染后逐漸呈上升趨勢[21-22]。IL-10主要由巨噬細胞和單核細胞產生，是一種有效的單核細胞、巨噬細胞減活化劑，減少單核細胞、巨噬細胞對促炎細胞的合成。在炎癥過程中，IL-10抑制促炎因子IL-1、TNF-α以及COX-2的作用產物前列腺素的分泌。還可通過激活巨噬細胞并減少星形膠質細胞的激活，抑制TNF-α、IL-6等促炎因子的合成和釋放，抑制損傷引起的繼發炎性反應和細胞因子表達，在燙傷后抗感染、抑制炎性反應方面發揮關鍵作用。TGF-β幾乎分布在所有的組織器官，多項研究表明TGF-β及其信號通路在抑制炎性反應、促愈合方面發揮關鍵作用[23]。納米晶體銀離子敷料能夠抑制炎性因子的表達，減輕炎性反應[24]。

本實驗見炎性因子IL-1早期稍上升，后期下降，說明創傷感染早期，炎性反應較強，后期由于治療干預逐漸下降，納米晶體銀鋅敷料組下降幅度最大，說明納米晶體銀鋅共同參與發揮抑菌抗炎的效果較好。TNF-α在創傷、炎癥發展過程中呈逐漸下降趨勢，納米晶體銀鋅敷料組下降幅度最大，亦說明抗菌抑制炎性反應效果較好。而炎性因子IL-10、TGF-β均呈逐漸上升趨勢，B組納米晶體銀鋅敷料組上升幅度最大，由于鋅離子能破壞細菌的DNA結構，亦能發揮一定的抗菌作用，因此納米晶體銀鋅敷料較納米銀敷料具有更好的抗菌、抑制炎癥作用。最后納米銀鋅敷料的愈合時間最短，因為敷料中的鋅離子促進壞死組織自溶與清除，加速肉芽組織生長和上皮形成，發揮了較好的促愈合、組織修復作用。

本實驗采用的新型納米晶體銀鋅敷料有較強的抗菌能力，由于敷料中成功引入了鋅離子，在抗菌、促進傷口愈合較納米銀敷料有更好的優勢。因此，新型納米晶體銀鋅敷料在創面感染治療過程中有較好的抗菌、抗炎及促愈合效果。

[參考文獻]

[1] Mahmoud WH，Mostafa W，Abdel-Khalek AH，et al. Effect of immune-enhancing diets on the outcomes of patients after major burns [J]. Ann Burns Fire Disasters，2014， 27（4）：192-196.

[2] Bangera D，Shenoy SM，Saldanha DR，et al. Clinico-microbiological study of Pseudomonas aeruginosa in wound infection and the detection of metallo-β -lactamase production [J]. Int Wound J，2016，13（6）：1299-1302.

[3] Tanideh N，Haddadi MH，Rokni-Hosseini MH，et al. The healing effect of Scrophularia Striata on experimental burn wounds infected to pseudomonas aeruginosa in rat [J]. World J Plast Surg，2015，4（1）：16-23.

[4] Feng ZZ，Zheng YR，You CG，et al. Basic investigation into the present burn care system in China：burn units，doctors，nurses，beds and special treatment equipment [J]. Burns，2015，41（2）：279-288.

[5] Ressner RA，Murray CK，Griffith ME，et al. Outcomes of bacteremia in burn patients involved in combat operations overseas [J]. J Am Call Surg，2008，206（3）：439-444.

[6] Stoller J，Halpin L，Weis M，et al. Epidemiology of severe sepsis：2008-2012 [J]. J Crit Care，2016，31（1）：58-62.

[7] 徐錫明，魏顯招，李明.戰創傷合并多重耐藥菌感染研究進展[J].第二軍醫大學學報，2014，35（3）：312-316.

[8] 李曉魯，黃躍生，彭毅志，等.納米晶體銀敷料治療燒傷后殘余創面的多中心臨床研究[J].中華燒傷雜志，2006， 22（1）：15-18.

[9] Barillo DJ，Marx DE. Silver in medicine：a brief history BC 335 to present [J]. Burns，2014，40：s3-s8.

[10] Holt KB，Bard AJ. Interaction of silver（i） ions with the respiratory chain of Escherichia coli：an electrochemical and scanning electrochemical microscopy study of the antimicrobial mechanism of micromolar Ag+ [J]. Biochem？鄄istry，2005，44（39）：13 214-13 223.

[11] Foldbjerg R， Olesen P，Houqaard M，et al. PVP-coated silver nanoparticles and silver ions induce reactive oxygen species，apoptosis and necrosis in THP-1 monocytes [J]. Toxicol Lett，2009，190（2）：156-162.

[12] Thomas S，McCubbin P. A comparison of the antimicrobial effects of four silver-containing dressings on three organisms [J]. J Wound Care，2003，12（3）：101-107.

[13] Thomas S. McCubbin P. An in vitro analysis of the antimicrobial properties of 10 silver-containing dressings [J]. Journal of wound care，2003，12（8）：305-310.

[14] Zhu X，Radovic-Moreno AF，Wu J，et al. Nanomedicine in the management of microbial infection-Overview and perspectives [J]. Nano Today，2014，9（4）：478-498.

[15] Singh R，Nalwa HS. Medical applications of nanoparticles in biological imaging，cell labeling，antimicrobial agents，and anticancer nanodrugs [J]. J Biomed Nanotechnol，2011，7（4）：489-503.

[16] 于勇，梁明，陳廷秀，等.納米晶體銀離子敷料對燒傷感染常見耐藥病原菌的體外抗菌活性[J].中華燒傷雜志[J].2006，22（4）：284.

[17] 楊景哲，陳鳳平，耿琪英，等. rhGM-CSF、納米銀對深Ⅱ°燙傷愈合過程炎癥反應的影響[J].武漢大學學報：醫學版，2014，35（5）：674-677.

[18] Mirastschijski U，Martin A，Jorgensen LN，et al. Zinc，cop？鄄per，and selenium tissue levels and their relation to subcutaneous abscess，minor surgery，and wound healing in humans [J]. Biol Trace Elem Res，2013，153（1/3）：76-83.

[19] Mirza RE，Fang MM，Weinheimer-Haus EM，et al. Sustained inflammasome activity in macrophages impairs wound healing in type 2 diabetic humans and mice [J]. Diabetes，2014，63（3）：1103-1114.

[20] 聶梅，董燕麟.燙傷早期TNFα與IL-1增強骨骼肌蛋白質分解代謝作用機制的研究[J].第三軍醫大學學報，2001，23（2）：172-175.

[21] 黃能，詹劍華，羅錦花，等.黃芪多糖對嚴重燙傷大鼠血清炎癥因子的影響[J].中華燒傷雜志，2015，31（4）：274-276.

[22] 段強，王冰水，單守勤，等.低強度激光照射對小鼠燙傷創面轉化生長因子-β1和白細胞介素-1β基因表達的影響[J].中華物理醫學與康復雜志，2015，37（3）：176-178.

[23] 梁永會，韓繼媛，邱紅根.腫瘤壞死因子-α及白細胞介素-1β在大鼠腎缺血后處理中的變化和意義[J].廣東醫學，2011，32（14）：1809-1811.

[24] 王瀅，宋建星，陳紅萍，等.納米銀活性炭纖維敷料促進大鼠壓瘡創面愈合[J].第二軍醫大學學報，2015，36（10）：1051-1055.

（收稿日期：2017-11-17 本文編輯：李岳澤）