洋蔥CMS-T型育性分子標記的篩選與鑒定

潘美紅，楊海峰，惠林沖，薛 萍，張新圣，繆美華，陳振泰

(連云港市農業科學院，江蘇連云港 222000)

洋蔥(AlliumcepaL.)屬單子葉天門冬目(Asparagale)百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)的重要園藝作物[1]，已有4 000多年的栽培歷史，被世界各地廣泛栽培[2]。聯合國糧食與農業組織2012調查數據顯示：中國是生產洋蔥最多的國家，達到2.05×107t[3]，主要用于外貿出口和國內消費。目前國內洋蔥雜交種主要以進口日本和韓國為主，缺乏自主雜交品種。

洋蔥是2 a生植物，在雜交育種中，1個世代需跨越3個年份，異花授粉，傘狀花序，花小，結籽率低，人工去雄困難，所以利用洋蔥細胞質雄性不育(CMS，cytoplasmic male sterility)系選育雜交種尤為重要。首次報道在洋蔥品種‘Italian Red’[4]和‘Jaune paille des Vertus’[5]中分別發現CMS-S和CMS-T 2種細胞質雄性不育類型。利用現代DNA分子標記技術，PCR擴增能夠快速鑒定洋蔥雄性細胞質不育類型；Sato[6]利用cob標記能夠區分CMS-S型，而不能區分正?？捎?N)和CMS-T；Engelke等[7]利用 orfA501標記在洋蔥不育株中擴增出473 bp條帶，可育株沒有或很弱，與cob標記相結合區分洋蔥可育株N、CMS-S和CMS-T，陳沁濱等[8]和吳海濤等[9]利用此標記將洋蔥材料101A鑒定為CMS-S和將8A鑒定為CMS-T。Havey[10]在洋蔥葉綠體DNA中開發出Cp-cytotype標記，Kim等[11]利用線粒體DNA中的cob-type2和 atp6標記都能將CMS-S型鑒定，但不能區分正常可育株N和CMS-T，而Kim等[12]利用洋蔥線粒體DNA中相關細胞色素c氧化酶亞基I(coxI，cytochromecoxidase subunit I)基因，該基因連接到洋蔥 orfA501同系物序列上，與韭菜 orfA501序列相比，其含有 atp9基因的5’序列，由coxI和 orfA501同源物組成2 175 bp連續開放閱讀框的嵌合序列，并開發出新的標記命名為 orf725，能夠將洋蔥3種類型完全區分開。洋蔥的細胞質雄性不育表現為母系遺傳，主要是由線粒體和葉綠體基因中片段差異造成的[13-14]。目前，針對洋蔥的N、CMS-S和CMS-T 3種類型葉綠體DNA基因組已公布，研究表明，可育株N(GenBank數據中登錄號：KM088013，下同)和CMS-S(KM088014)核苷酸之間有352個SNPs和141處片段插入或缺失，多態性豐富，而N和CMS-T(KM088015)核苷酸之間有4個SNPs和2處片段插入，根據petN和psbM基因之間的差異，設計Cpp1分子標記，能夠利用簡單的PCR將洋蔥的N、CMS-S和CMS-T 3種類型完全區分開[15]。隨后Kim等[16]發表洋蔥CMS-S線粒體DNA基因組，序列全長316 363 bp，GenBank數據中登錄號：KU318712。洋蔥葉綠體和線粒體DNA基因組的公開發表，將更有利于洋蔥細胞質雄性不育機制的研究。

國外已經利用恢復基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)生產洋蔥F1雜交種。洋蔥不育株可以通過有無花粉判斷，而保持系則需要不斷地雜交、回交來選擇，其隨機性大、選育周期長。近年來，RAPD[17]、RFLP[18]、AFLP等[19]分子標記研究洋蔥細胞質雄性不育和可育材料的多態性，并開發鑒定洋蔥育性遺傳位點的分子標記。Jones等[4]研究認為CMS-S不育由1對隱性細胞核基因(msms)控制，而Schweisguth[20]認為CMS-T可能是3個獨立的細胞核基因共同控制，雜交后代分離比較復雜，Kim[21]認為洋蔥2種不育類型都是由單核基因Ms位點控制，開發出jnurf13分子標記，適合CMS-S和CMS-T 2種類型，并且與Ms位點緊密連鎖。所以，通過開發分子標記鑒定純合的恢復基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)的基因型對雜交制種尤為重要，能夠顯著縮短育種年限和減少工作量。目前，國內洋蔥雜交種生產相關報道很少，尤其是中日照洋蔥品種。本試驗擬用cob(s)、cob(n)、 orfA501、Cpp1、 orf725 、jnurf13、AcSKP1、DNF-566、RNS-357、OPT和PsaO共11個與洋蔥育性相關的分子標記，對連云港市農業科學院蔬菜課題組(以下簡稱本課題組)選育的洋蔥不育系材料進行驗證，篩選出簡單、高效的分子標記，為洋蔥育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

洋蔥試驗材料的生態類型為中日照，全部來自于連云港市農業科學院蔬菜研究室，共34份，分別編號為1～34號，供試材料名稱和特點見表1，D9和d9、A1和a1、A3和a3、A-2和a-2、A-3和a-3、T和t分別為相配套的不育系和保持系，6套不育系材料引種名稱、來源、單位和時間見表2，其中D9和d9、A1和a1為2套穩定的不育系。表1中13號材料是母本黃皮不育株A-2與父本紅皮保持株t雜交的粉皮F1(A-2×t)，14號是母本粉皮不育株13號與父本紅皮保持系t進行回交的紅皮BC1[(A-2×t)×t]。紅皮洋蔥材料406中篩選出4株不育株，并與406材料中可育株t2、t5、t6、t11分別進行雜交獲得F1，分別命名為T-2-2、T-1-5、T-2-6和T-7-11；同時對可育株t2、t5、t6、t11進行自交獲得F1，即表1中t-2、t-5、t-6和t-11；512、728、562、B1、H1、911、930、932和948為常規資源材料；T8×512、T10×728、T2×562 3份 材料為雜交種F1。

1.2 試驗方法

試驗材料在連云港市農業科學院蔬菜試驗基地種植，1～14號材料在開花期分別取其1～2片嫩葉，并調查統計是否有花粉，套袋自交，15～34號為隨機選取的洋蔥鱗莖球，取5～10 g鱗莖片，液氮保存，用北京天根DNA試劑盒(型號：DP350-03)提取洋蔥基因組DNA，引物由蘇州金唯智生物有限公司合成(表3)，PCR擴增試劑購置于TAKARA公司，反應體系為25 μL，包括：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10× PCR buffer，1.25 μL(10 μmol/L)正向引物，1.25 μL(10 μmol/L)反向引物，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.25 μLTaq酶和15.8 mL ddH2O。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min[22]，AcSKP1采用MK886、MK898、MK620、和MK628四對引物混合PCR 擴增，反應條件參考Huo等[23]，jnurf13的PCR反應條件參考Kim[21]的方法。cob(s)、cob(n)、 orfA501、 orf725、DNF-566和RNS-357的PCR產物采用質量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠進行檢測，Cpp1、jnurf13、AcSKP1、OPT和PsaO的PCR產物采用8%的聚丙烯酰氨凝膠(464 mL/L H2O，250 mL/L 1 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，266 mL/L 30% Acrylamide，10 mL/L 10% SDS，10 mL/L 10%(NH4)2S2O8，0.6 mL/L TEMED)電泳檢測，電壓100 V，電泳3 h，硝酸銀染色，采用佳能EOS6D相機在膠片燈上拍照記錄。

表1 供試洋蔥材料編號、株系及特點Table 1 Code,lines and characteristics of tested onion materials

表2 洋蔥6份不育材料來源及關系Table 2 Sources and relationship of six onion materials

表3 洋蔥分子標記引物Table 3 Primer sequences of molecular markers in onion

2 結果與分析

2.1 洋蔥細胞質雄性不育類型鑒定

2.1.1 洋蔥不育株表型觀察 當洋蔥傘狀花序上的花朵開裂達到40%～ 60%時，觀察結果顯示，正?？捎昊ǘ渲行廴镲枬M，花藥和花粉囊開裂后能夠正常彈出花粉(圖1-A)，且套袋自交后能夠正常結籽。洋蔥的不育株花朵開裂后，雄蕊較弱，花藥在發育過程中漸漸萎縮干枯，無花粉粒彈出，套袋自交不結籽(圖1-B)。對洋蔥材料1～14 號進行表型觀察和套袋后，1～6號洋蔥花藥有花粉彈出，套袋自交結籽，說明是可育株；7～14 號洋蔥花藥無花粉彈出，套袋自交未結籽，說明是不育株。

圖1 洋蔥可育株(A)和不育株(B)花序形態特性Fig.1 Morphological characteristics of fertile flowers (A) and sterile flowers (B)

2.1.2 洋蔥不育類型鑒定 采用cob標記對1～14 號洋蔥材料進行PCR擴增，cob(s)標記結果顯示在414 bp大小處沒有條帶或很弱，初步說明1～14號都不是S型不育(圖2-A)，而cob(n)標記結果顯示只在180 bp大小處條帶很亮，說明1～14 號是可育或T型細胞質不育；用 orfA501標記引物只能在不育系中擴增出473 bp大小的條帶,而可育系中沒有或者很弱，結果顯示1～6號沒有條帶或很弱，而7～14號擴增出473 bp，條帶清晰，結果與Sato等[6]和Engelke等[7]報道一致，以上分子標記結果表明：洋蔥材料1～6 號是可育株，7～14號為CMS-T不育株。 orf725[12]能夠在可育株中擴增出1條833 bp的條帶，T型中擴增出833 bp和628 bp 2條帶，而在S型中只能擴增出1條628 bp的條帶，結果顯示本試驗材料1～6號PCR擴增出1條帶，說明是可育株，7～ 14號擴增出2條帶，為CMS-T型不育株。Cpp1[15]標記是根據洋蔥葉綠體基因組DNA核苷酸序列的差異開發出的標記，能夠在可育株中擴增出1條264 bp的條帶，T型中擴增出1條307 bp的條帶，而在S型中擴增出1條254 bp的條帶，由于3條帶大小差異只有10～53 bp，PCR產物采用聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)檢測，從圖2-E中看出1條307 bp很亮的條帶和1條264 bp亮度較弱的條帶，不能有效區分本試驗材料的不育類型。

株系1 Breeding lines 1.d9；2.a3；3.a-3；4.a1；5.t；6.a-2；7.D9；8.A3；9.A-3；10.A1；11.T；12.A-2；13.A-2×t；14.(A-2×t)×t；A.cob(s)；B.cob(n)；C. orfA501；D. orf725；E.Cpp1

圖2不同引物對洋蔥不育類型鑒定
Fig.2Identificationofonionsteriletypewithdifferentprimers

2.2 洋蔥育性恢復基因型(Ms)驗證

本課題組早期通過傳統的雜交、回交在洋蔥同一品種中篩選出穩定的保持系和不育系d9和D9、a1和A1，選用前人報道的DNF-566、RNS-357、jnurf13、PsaO、OPT和SKP1[23](MK886、MK898、MK620、MK628)共6個分子標記對1～34號材料進行驗證，DNF-566標記能夠在含有Ms位點中擴增出556 bp，RNS-357標記只在含有ms位點的洋蔥中擴增出1條357 bp的條帶，而含有Msms中能同時擴增出2條帶。結果表明1～4、6～19、23、28、29、31和33號材料顯示只有1條357 bp的條帶，說明該材料基因型為msms；21、24和26號擴增出1條566 bp的條帶，基因型為MsMs；22、25、30、32和34號擴增出2條帶，其中25和32號2條帶較弱，基因型為Msms；而5、20和27 3個材料2個標記均無條帶(圖3-A和圖3-B)。

OPT標記能夠在含有Ms位點中擴增出1條659 bp的條帶，在含有ms位點中擴增出1條357 bp的條帶，而含有Msms中能同時擴增出2條帶，同樣PsaO能夠在含有Ms位點中擴增出1條490 bp的條帶，在含有ms位點中擴增出1條437 bp的條帶，而含有Msms中能擴增出2條帶。結果顯示OPT分子標記鑒定結果與PsaO分子標記互相矛盾，如11、14、22和24號，OPT標記鑒定為MsMs，而PsaO鑒定為Msms；16、27、30、31和34號，OPT標記鑒定為Msms，而PsaO鑒定為MsMs；2個分子標記鑒定結果相同的為5、15、20、28、29和33號，基因型為MsMs，23和25號為Msms，其他均不同(圖3-C和圖3-D)，所以，OPT和PsaO標記不適合作為本試驗材料的篩選Ms遺傳位點。

為了能夠準確鑒定洋蔥可育株N、CMS-S和CMS-T 3種類型，Kim[21]報道的jnurf13分子標記可以用于區分3種類型，能夠在含有Ms位點中擴增出1條241 bp的條帶，在含有ms位點中擴增出1條229 bp的條帶，而含有Msms中能擴增出2條帶。Huo等[23]開發出的SKP1標記能夠區分洋蔥可育株N和CMS-S 2種類型，能夠在含有Ms位點中擴增出1條898 bp的條帶，在含有ms位點中擴增出1條628 bp的條帶，而含有Msms中能擴增出2條帶，但未對T型細胞質雄性不育類型進行報道。本試驗材料中包括CMS-T類型，結果發現jnurf13和SKP1標記的結果完全一致，2個標記顯示7～14號基因型為msms，且為不育株，與表型觀察的結果相符合，20、21、24、26和27號5個材料基因型為MsMs，5、22、23、25、30、33和34號7個材料基因型為Msms，其他22個材料基因型為msms。對6個標記結果分析表明，DNF-566、RNS-357、jnurf13和SKP1中7～14號符合Ms遺傳規律(表4)，基因型為純合msms不育株，初步分析表明：jnurf13和SKP1標記適合本材料篩選Ms遺傳位點。

不同洋蔥材料1 Different onion materials 1.d9；2.a3；3.a-3；4.a1；5.t；6.a-2；7.D9；8.A3；9.A-3；10.A1；11.T；12.A-2；13.A-2×t；14.(A-2×t)×t；15.t-11；16.t-2；17.t-5；18.t-6；19.512；20.728；21.562；22.B1；23.H1；24.911；25.930；26.932；27.948；28.T-7-11；29.T-2-2；30.T-1-5；31.T-2-6；32.T8×512；33.T10×728；34.T2×562。A.DNF-566；B.RNS-357；C.OPT；D.PsaO；E.jnurf13；F.SPK1

圖3 洋蔥Ms位點分子標記PCR驗證Fig.3 Identification of simple PCR markers linked to the Ms locus in onion

注：A.顯性純合子(MsMs)；H.雜合子(Msms)；B.隱性純合子(msms)；D.顯隱性純合子或雜合子(MsMs，Msms，msms)。

Note:A.homozygous dominant (MsMs)； H.heterozygous (Msms)； B.homozygous recessive (msms)；D.homozygous dominant,homozygous recessive,or heterozygous(MsMs,Msms,msms).

2.3 洋蔥不同標記實用性比較

綜合比較洋蔥不育系鑒定相關分子標記cob(s)、cob(n)、 orfA501、 orf725和Cpp1，其中 orf725能夠簡單、快速的鑒定洋蔥N、CMS-S和CMS-T 3種類型。與洋蔥育性相關的6個分子標記jnurf13、AcSKP1、DNF-566、RNS-357、OPT和PsaO中(表5)，其中jnurf13和AcSKP1能夠準確鑒定本試驗材料，包括CMS-T類型，AcSKP1采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用時少、速度快，但其采用混合PCR擴增比jnurf13普通PCR擴增所用試劑成本高，jnurf13標記試劑成本較低，比較適合生產應用。

表5 洋蔥不同標記實用性比較分析Table 5 Comparison and analysis of different marks of onion

3 討 論

洋蔥細胞質雄性不育系是解決洋蔥雜交制種最有效的途徑之一，在生產實踐中，通過田間觀察，易發現不育株，進一步通過分子標記來驗證不育類型。自Jones等[4]和Berninger等[5]報道洋蔥CMS-S和CMS-T，很多分子標記被用來區分不育類型，Cp-cytotype[25]、cob[6]、atp6和cob-type2[11]都只能區分CMS-S型，且有的PCR擴增后還需要進行后續酶切反應。orf501[7]只能區分不育和可育株，需要和上述鑒定S型的標記聯合分析，才能將洋蔥N、CMS-S和CMS-T區分開(圖2-A、圖2-B、圖2-C)， orf725[12]和Cpp1[15]可以用簡單的PCR區分洋蔥3種類型，本試驗材料中用 orf725分子標記能夠區分N和CMS-T類型，與cob和orf501結果一致，而Kim等[15]利用葉綠體基因組DNA開發的Cpp1標記能夠區分3種類型，Cpp1標記分析130份來源于不同國家地區的栽培種，發現83份N型中含有54 bp的插入，與CMS-T完全一致，但無法區分N和CMS-T 2種類型。本試驗中1～14號為N與CMS-T類型，PCR擴增條帶大小完全一致，不能有效地進行區分，與Kim報道結果一致，其同時提出新的模型，即正?？捎闚分為N-Type1，含有43 bp插入的為N-Type2，CMS-T分為CMS-T-Type1，含有1 bp 的SNP的插入類型為CMS-T-Type2。本試驗中的1～6號按此分類對應是N-Type2，其他還需要進一步測序分析。雖然洋蔥CMS-S型線粒體基因組DNA已發布，但還需要進一步研究分析SNP三者之間的差異。比較上述分子標記在隨機材料中驗證不育株的類型，結果表明 orf725分子標記最為簡單、經濟實用。

控制洋蔥育性相關的基因研究，最早由Jones等[4]提出CMS-S由Ms基因控制，Schweisguth等[20]認為CMS-T由3個獨立的細胞核基因共同控制，隨著分子標記的廣泛應用，ACms.1100[17]、jnurf05和jnurf17[26]、jnurf12和jnurf13[21]、OPT和PsaO[27]、WHR240[28]、PMS1[29]、DNF-566和RNS-357[19]、Ms[30]等與Ms位點相關標記被開發應用，12個分子標記中，只有jnurf12和jnurf13標記報道3種類型(N、CMS-S和CMS-T)，其他10個標記只報道N、CMS-S 2種材料，其中ACms.1100和PMS1標記都以‘506L’為CMS材料，并未指出S或T型，而本試驗不育材料都為CMS-T型。ACms.1100標記位于jnurf17和jnurf06標記之間， jnurf12標記沒有與任何重組體的Ms基因座完美連接，比位于0.05 cM距離的jnurf05標記更接近于Ms基因座，然而，當用jnurf12標記分析不同來源的CMS-S時，標記基因型出現差異。jnurf13是位于jnurf12標記側翼的約5.5 kb序列，依據有12 bp的插入，開發設計出jnurf13分子標記適合洋蔥3種不同類型的鑒定[21]。jnurf13分子標記驗證1～34號材料，7～14號為不育系，33和34號為雜交種，驗證結果與表型完全一致，所以，本試驗結果支持Kim提出的洋蔥3種類型(N、CMS-S和CMS-T)是由Ms位點控制，同時，AcSKP1分子標記驗證結果與jnurf13標記完全一致，首次報道AcSKP1標記適合本試驗提供的細胞質雄性不育T型。DNF-566和RNS-357標記只能分別鑒定Ms和ms，2個標記結合分析，5、20和27號經重復PCR擴增試驗后無條帶(圖3-A、圖3-B)，排除人為操作或試劑儀器等問題，其他31份材料中，只有23、32和33號3個材料結果與jnurf13、SKP1不一致，其他完全一致，尤其是7～14號CMS-T材料，3個標記結果完全一致，更進一步支持Kim的觀點。而Huo等[27]報道的PsaO和OPT標記，基于‘506L’和‘H6’ 2個品種的F1和F2，而對于田間隨機的CMS-S材料就不能完全適應，發現2個標記與其他3個標記結果有很多不同之處，所以，PsaO和OPT標記不適合作為本試驗材料的Ms育性相關標記的驗證。

另外，在洋蔥中報道的標記ACms.1100，不能確定是連鎖標記或功能標記[17]；WHR240標記基于洋蔥花蕾期cDNA序列，操作繁瑣[28]；Ms標記能夠在田間直接應用篩選S型不育系和保持系[31]，但CMS-T是否適合并未報道。而最新研究報道基于洋蔥材料混合群體分離分析法(BSA)和轉錄組測序(RNA-seq)得到30個與Ms遺傳位點相關候選基因，其中14個連鎖不平衡，并對其cDNA全長測序，在可育株和不育株間進行氨基酸比對，發現有4個基因的氨基酸有差異，其中的 PMS1基因組DNA中有錯配修復，是最好的候選基因標記，并對其進行相關驗證[29]，但是否適合本試驗材料還需進一步驗證。盡管jnurf13和AcSKP1標記適合本試驗材料，但是從生產應用選育恢復基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)角度考量，AcSKP1分子標記采用的是混合PCR，試劑耗材成本相對高，而jnurf13分子標記適用于簡單PCR驗證，所以，jnurf13分子標記更適合在洋蔥大田生產中應用。

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