右美托咪定對脂多糖刺激后大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制

周俊杰，肖偉，何璇，彭娜，童華生，蘇磊

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。膿毒癥相關(guān)性腦病系膿毒癥臟器功能損傷之一，可表現(xiàn)為多種形式，包括注意力或定向力損傷、譫妄、昏迷等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，腦功能障礙是膿毒癥患者不良預(yù)后的重要因素[3]，對于存活患者，可遺留記憶力下降、注意力改變等不同程度的認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[4]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，被認(rèn)為是革蘭陰性菌感染產(chǎn)生全身癥狀的主要誘因[5]。LPS可刺激炎癥因子的生成進(jìn)而造成細(xì)胞損傷。Toll樣受體家族(Tolllike receptors，TLR)是一類跨膜受體蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色，其中TLR4主要識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)介導(dǎo)天然免疫，LPS是其重要的活化物。在LPS刺激下，TLR4可通過細(xì)胞內(nèi)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)誘導(dǎo)NF-κB活化，增加多種炎癥因子表達(dá)，放大炎癥反應(yīng)[6]。鎮(zhèn)靜藥物右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種高效的α2腎上腺素受體激動劑，可激動突觸前膜α2受體，抑制去甲腎上腺素的釋放，并終止疼痛信號的傳導(dǎo)[7]。DEX可通過血腦屏障，具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮作用，在ICU中得到了廣泛的應(yīng)用[8-9]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，DEX可減輕LPS導(dǎo)致的內(nèi)毒素血癥小鼠神經(jīng)元損傷[10]，但其機(jī)制尚不明確。來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株P(guān)C12是神經(jīng)系統(tǒng)體外研究應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞株，因此，本研究探討了DEX在LPS所致大鼠神經(jīng)元損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DEX由江蘇新晨醫(yī)藥股份有限公司提供。MTT、Hoechst購自美國MP公司，DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒購自美國eBiosience公司。TLR4及MyD88抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 PC12細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，使用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。LPS干預(yù)前2h更換為無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)。第一部分分組及處理：①對照組：給予常規(guī)培養(yǎng)；②LPS 3、6、12h組：按照文獻(xiàn)報(bào)道濃度[11]，給予400μg/ml LPS刺激，分別在作用3、6、12h后進(jìn)行檢測，找到峰值作用時(shí)間，作為第二部分實(shí)驗(yàn)檢測點(diǎn)。第二部分分組及處理：①對照組：給予常規(guī)培養(yǎng)；②LPS組：給予400μg/ml LPS刺激；③DEX組：按照文獻(xiàn)報(bào)道的最佳保護(hù)濃度[12]，給予100μmol/L DEX；④LPS+DEX組：同時(shí)給予400μg/ml LPS及100μmol/L DEX，各組在第一部分確定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測。

1.3 細(xì)胞存活率檢測 將細(xì)胞接種于96孔板中，按上述方式干預(yù)后，使用MTT法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。具體步驟為：棄去96孔板中原培養(yǎng)基，每孔加入0.5mg/ml MTT溶液150μl，37℃避光孵育4h后，去除含有MTT的溶液，每孔加入DMSO溶液150μl，置搖床上避光低速振蕩10min，在酶標(biāo)儀490nm處測量各孔的吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率=模型組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡分析 采用Hoechst染色法進(jìn)行分析。首先棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛冰上固定15min，PBS清洗后，再加10μg/ml Hoechst工作液37℃染色10min，置于熒光倒置顯微鏡以激發(fā)光360nm、發(fā)射光420nm觀察并記錄。

1.5 細(xì)胞上清TNF-α、IL-6水平檢測 收集細(xì)胞上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行測定，顯色反應(yīng)終止后，使用酶標(biāo)儀在450nm處檢測各孔OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔TNF-α、IL-6濃度。

1.6 細(xì)胞TLR4、MyD88、p-65、p-p65表達(dá)水平檢測 采用Western blotting法，細(xì)胞經(jīng)裂解提取蛋白，BCA法定量后，行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜并封閉后，分別與兔源抗TLR4(1:1000)、MyD88(1:1000)、p-65(1:1000)、p-p65(1:1000)的激活型一抗孵育，繼而與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:5000)作用，經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑顯跡，采用Image J進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以表示，進(jìn)行正態(tài)分布性檢驗(yàn)后，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LPS對PC12細(xì)胞活力及細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平的影響 400μg/ml LPS刺激PC12細(xì)胞后，與對照組相比，3h時(shí)細(xì)胞活力即明顯下降，6h后進(jìn)一步下降，而12h時(shí)細(xì)胞活力情況與6h接近(P<0.05)。LPS刺激后，細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α水平明顯上升，3、6、12h組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在6h達(dá)到峰值(圖1)。

2.2 LPS對PC12胞內(nèi)TLR4、MyD88、p-p65表達(dá)水平的影響 Western blotting結(jié)果顯示，LPS刺激后，PC12中TLR4、MyD88、p-p65水平均明顯升高(圖2)，在LPS刺激6h后達(dá)到高峰。結(jié)合前述LPS刺激后細(xì)胞上清中的IL-6及TNF-α變化結(jié)果，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取LPS刺激6h作為檢測時(shí)間點(diǎn)。

圖1 LPS刺激對PC12細(xì)胞活力(A)及細(xì)胞上清IL-6(B)、TNF-α(C)水平的影響Fig.1 Effects of LPS on PC12 cell viability (A), concentrations of IL-6 (B) and TNF-α (C) at different time points

圖2 LPS對PC12胞內(nèi)TLR4(A)、MyD88(B)、p-p65(C)表達(dá)水平影響的時(shí)間效應(yīng)Fig.2 Effects of LPS on the expressions of TLR4 (A), MyD88 (B) and p-p65 (C) in PC12 cells at different time points

2.3 DEX對LPS刺激的PC12細(xì)胞活力及凋亡的影響如圖3A所示，同時(shí)給予400μg/ml LPS及100μmol/L DEX的LPS+DEX組，PC12細(xì)胞活力較LPS組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Hoechst染色結(jié)果(圖3B)顯示，對照組與DEX組細(xì)胞均勻著色，僅個別細(xì)胞呈強(qiáng)熒光，提示基礎(chǔ)凋亡率極低；在LPS刺激后，著亮藍(lán)色細(xì)胞明顯增多，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多；LPS+DEX組凋亡細(xì)胞數(shù)較LPS組減少，提示DEX可減輕LPS誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

圖3 DEX對LPS刺激PC12細(xì)胞6h后細(xì)胞活力(A)及細(xì)胞凋亡水平(B, Hoechst staining, ×200)的影響Fig.3 Ef f ects of dexmedetomidine on the cell viability (A) and apoptosis rate (B, Hoechst staining, ×200) of LPS-treated PC12 cells

2.4 DEX對LPS刺激后PC12細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平的影響 細(xì)胞上清IL-6濃度測定結(jié)果顯示，對照組濃度為71.50±25.33pg/ml，DEX組為58.72±30.40pg/ml，兩組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；LPS刺激6h后上升至652.64±159.17pg/ml，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LPS與DEX共處理6h后，IL-6濃度為338.51±114.52pg/ml，與LPS組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞上清TNF-α濃度測定結(jié)果顯示，對照組濃度為36.39±12.89pg/ml，單用DEX作用后濃度為55.87±17.90pg/ml，兩組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；LPS刺激6h后較對照組明顯升高，至476.74±73.90pg/ml(P<0.05)；LPS與DEX共處理6h后，TNF-α濃度為305.34±62.99pg/ml，與LPS組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。結(jié)果提示DEX可減輕LPS誘導(dǎo)的PC12促炎因子釋放。

圖4 DEX對LPS刺激PC12細(xì)胞6h后IL-6(A)、TNF-α(B)分泌水平的影響Fig.4 Effects of dexmedetomidine on the concentrations of IL-6 (A) and TNF-α (B) in the supernatants of LPS-treated PC12 cells

2.5 DEX對LPS刺激后PC12細(xì)胞TLR4、MyD88、p-p65表達(dá)水平的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，DEX與LPS共處理后，PC12細(xì)胞中TLR4、MyD88、p-p65表達(dá)水平均較LPS組下降；經(jīng)Image J灰度分析，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 DEX對LPS刺激PC12細(xì)胞6h后胞內(nèi)TLR4(A)、MyD88(B)、p-p65(C)表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of dexmedetomidine on the expressions of TLR4 (A), MyD88 (B) and p-p65 (C) in LPS-treated PC12 cells

3 討 論

膿毒癥相關(guān)性腦病是膿毒癥的嚴(yán)重并發(fā)癥，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能的機(jī)制包括血腦屏障損傷、腦血流改變、神經(jīng)遞質(zhì)失衡及炎癥因子的作用等[13]。膿毒癥患者腦脊液中白細(xì)胞明顯升高，提示存在內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血腦屏障功能障礙，細(xì)菌及其毒素進(jìn)入中樞，直接造成神經(jīng)元不同程度的損傷。膿毒癥相關(guān)性腦病可導(dǎo)致病死率明顯升高，但目前尚無特效的治療。DEX是咪唑啉的衍生物，是一種新型α2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗交感、穩(wěn)定血流動力學(xué)等多種作用，同時(shí)大劑量時(shí)對呼吸系統(tǒng)的抑制作用輕微，安全性好，因此作為麻醉輔助用藥被廣泛應(yīng)用于ICU及麻醉科。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，DEX具有抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用，可改善腦缺血-再灌注、創(chuàng)傷等導(dǎo)致的顱腦損傷[14-17]；在膿毒癥的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，DEX可提高膿毒癥患者28d生存率[18]；有關(guān)內(nèi)毒素血癥的動物研究結(jié)果表明，DEX可改善實(shí)驗(yàn)動物腸道黏膜的血管灌注，減輕腸屏障功能損傷，減輕循環(huán)中的細(xì)菌數(shù)[19]；DEX預(yù)處理亦可減緩LPS刺激的大鼠腎臟和肺臟組織中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-18等的釋放，減輕腎臟、肺臟的組織損傷[20-21]；Ning等[10]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEX同樣可減輕內(nèi)毒素血癥小鼠腦組織中的TNF-α和IL-6水平，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究以PC12為研究對象，發(fā)現(xiàn)DEX可抑制LPS刺激后細(xì)胞內(nèi)TLR4水平的升高，進(jìn)而抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活化，降低TNF-α和IL-6水平，減少細(xì)胞凋亡。

Toll樣受體是一類天然免疫受體，最初在果蠅中發(fā)現(xiàn)，隨后在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)其廣泛表達(dá)，在天然免疫防御中發(fā)揮重要作用。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個Toll家族蛋白，除了表達(dá)于參與宿主防御功能的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞以外，在腎小管上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞等全身多個臟器細(xì)胞中表達(dá)[22-23]。TLR4通過識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)的特有抗原成分而進(jìn)行信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)，LPS是其重要的配體。LPS與TLR4結(jié)合后，其胞內(nèi)段可與MyD88羧基端結(jié)合，進(jìn)而通過IL-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)激活NF-κB，促進(jìn)多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。本研究觀察到，DEX可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活化，降低TNF-α和IL-6水平，這與Liu等[24]在膿毒癥肺組織中得到的結(jié)果一致。此外，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路除了在急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用外，同樣參與認(rèn)知障礙等晚期并發(fā)癥的病理過程[25-26]，提示DEX可能對改善膿毒癥相關(guān)性腦病患者遠(yuǎn)期生存質(zhì)量有一定益處。

炎癥介質(zhì)的大量釋放也是導(dǎo)致膿毒癥相關(guān)性腦病的重要因素。膿毒癥患者循環(huán)中存在大量炎癥介質(zhì)，同時(shí)患者血腦屏障損傷，炎癥介質(zhì)可進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)一步導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，且刺激神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)，形成惡性循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者腦脊液中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1明顯升高，且其升高程度與預(yù)后明顯相關(guān)[27]。DEX除可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路降低TNF-α和IL-6水平外，亦可抑制c-Jun氨基末端激酶，減少TNF-α和IL-6的表達(dá)，且呈劑量依賴性[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，DEX可明顯降低LPS刺激后PC12細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6水平，達(dá)到神經(jīng)元保護(hù)的目的。

由于血腦屏障存在，許多藥物對神經(jīng)元的作用受到了一定限制。DEX作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)用藥，同時(shí)具有良好的抗炎作用，進(jìn)一步明確其機(jī)制及適宜的應(yīng)用劑量對改善膿毒癥相關(guān)性腦損傷具有重要意義。

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