c-JNK信號通路對糖尿病大鼠心肌鉀通道重構的氧化還原調控機制

李學永，孫毅，鄭明奇，石克威，曾偉，卜雪芹，孫賀建，胡占軍，劉剛

糖尿病(DM)可引起心肌細胞鉀通道(Kv)重構，特別對瞬時外向鉀電流(Ito)產生影響[1]，這會導致心肌動作電位時程延長和不應期改變[2-3]，同時也會致使Ca2+調節障礙及收縮減弱，從而使心肌收縮性和電興奮性異常，易導致心律失常和心力衰竭等心血管并發癥[4]。最近有研究指出，DM誘發的電壓門控性Kv重構是由心肌細胞氧化應激和氧化還原狀態轉換所介導的，存在于胞質中由硫氧還蛋白(Trx)、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)和還原型輔酶組成的Trx系統，可使Kv處于穩定的還原狀態，在Kv調節過程中有重要作用。目前對DM心肌氧化應激通過Trx系統介導心肌細胞Kv重構的研究較少，引起Kv通道重構及Ito密度下降的細胞內信號機制尚不清楚。在多種細胞中，氧化應激均可作為一種代償性反應增加多種酶系統的活性，其中包括JNK[5-6]。JNK信號傳導通路是MAPK信號通路家族成員之一。JNK是廣泛存在于細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞外界信號從細胞表面轉導到細胞核內部的重要傳遞者，在眾多的疾病進展過程中起著重要的作用[7]。SP600125是一種常用的JNK1信號通路高選擇性抑制劑，可以通過競爭性結合ATP位點抑制JNK1活性。本研究從分子生物學和電生理方面觀察DM對左室心肌細胞氧化還原水平和復極Ito密度的影響，探索細胞凋亡信號調節酶c-JNK在Kv通道重構中的作用，以期為DM心血管并發癥的發病機制尋找一個新的突破點，從而為預防DM患者心臟功能下降和心律失常提供更有效地臨床指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及配制 Tyrode液、無鈣Tyrode液、DMEM離體心臟灌流液，膠原酶Ⅰ、Ⅳ，蛋白酶E(Sigma公司，美國)；小牛血清白蛋白(BSA，Roche公司，瑞士)。測定Ito離子流的電極內液(mmol/L)：天門冬氨酸鉀(K-aspartate)130，MgCl22.0，依他酸(EGTA)11，Na-HEPES 10，CaCl20.5，Na2ATP 2.0，Na-GTP 0.1，用KOH調節pH至7.1~7.2。測定Ito離子流的灌流液(mmol/L)：NaCl 132，KCl 4.0，CaCl22.0，MgSO41.2，HEPES 20，Glucose1.1，用NaOH調節pH至7.35。TE緩沖液(mmol/L)：Tris-HCl 10，EDTA 1，pH 7.4。

1.2 實驗對象及分組 健康SD大鼠由河北醫科大學實驗動物中心提供，雄性，6~8周齡，體重180~200g。將45只SD大鼠隨機分為DM組(n=25)和對照組(n=20)。DM組大鼠給予高糖高脂飲食飼養，單次腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)檸檬酸緩沖液65mg/kg，3d后采集尾靜脈血測量血糖，血糖濃度在16.7~25.0mmol/L認為建立DM模型成功，STZ誘導成模共24只。對照組大鼠普通飲食飼養，單次腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。4周時DM組2只死亡，最后進入實驗DM組22只，對照組20只，作為相關實驗DM組及對照組的取材動物。

1.3 左室心肌細胞分離 采用膠原酶分解法獲得單個分離的左室心肌細胞。大鼠稱重并測血糖后用3%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，開胸迅速剪下心臟并置于4℃肝素化的正常Tyrode液中清洗修剪，沿其主動脈走行方向插入灌注導管，用Langendorff儀器沿主動脈逆向灌流心臟(37℃，90cmH2O)，使用D M E M灌流液，灌流液通以混合氣體(5%CO2、95%O2)。清洗灌流2~3min至心臟停止跳動，冠狀動脈變白，流出的液體變清亮。采用灌流酶液消化心臟15~20min，當流下的酶液滴數在100滴/min以上時，肉眼可見大鼠心臟脹大蓬松呈半透明狀，出現拉絲或者即將拉絲，此時停止消化。心臟消化完成后用50ml低鈣Tyrode液(含0.02mmol/L的CaCl2)沖洗殘留酶液，約3min可終止消化。剪下左室和室間隔部的心室組織并將其置于燒杯中，燒杯中預先倒入適量含有0.1%BSA的無鈣Tyrode液，用眼科剪細細剪碎心肌組織，然后用粗膠頭吸管輕輕吹打數次，36~37℃靜置溫孵5~10min，棄上清液后得到心肌細胞。將分離的左室心肌細胞放在細胞貯存液中，置于37℃孵育箱備用。

1.4 JNK活性測定 通過測定DM大鼠左室及室間隔心肌組織中的JNK磷酸化作用強度，來反映JNK激酶的活性度。采用非放射性JNK激酶分析元件(Cell Signaling Technology公司)進行測定。用裂解緩沖液將灌流消化后的左心室和室間隔部組織樣本分別制備成勻漿，4℃下15 000×g高速離心30min，提取上清液，留取4種測試樣本(對照左室組，n=4；DM左室組，n=4；對照室間隔組，n=4；DM室間隔組，n=4)，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白質測定法對蛋白質濃度進行測定。取0.4mg蛋白質用20μl固定化c-Jun融合蛋白顆粒懸浮液在4℃下孵化過夜；將免疫沉淀物用裂解緩沖液洗2次，再用酶緩沖液洗2次；再加入0.2mmol/L ATP，30℃下反應30min；加入4×Laemmli樣本緩沖液終止酶反應。取10μl上清液進行SDS-PAGE電泳，并用磷酸化c-Jun(Ser63)抗體檢測磷酸化c-Jun條帶，應用UVP生物成像系統進行分析，并使用多測量軟件(FujiF-ilm，Valhalla，NY)對結果進行量化，對比兩組左室及室間隔心肌組織中的JNK磷酸化強度。

1.5 全細胞膜片鉗記錄Ito電流 應用美國Axon公司的200B膜片鉗放大器。將玻璃微管(Sutter Instruments，Novato，CA)拉至內徑為1~2μmol/L的微電極，微電極(電阻2~5MΩ)內充滿電極內液，小心連接于電極支持裝置上，與膜片鉗放大器相連接。將數滴心室肌細胞懸液滴于帶有顯微鏡的工作臺上的灌流槽中，沉淀5~10min，待細胞沉底附壁后，用95%O2和5%CO2混合氣充分飽和過的灌流液(Ito電極外液)以1~2ml/min的速度恒速灌流，沖去死亡細胞碎片。在顯微鏡下選用形態良好的心肌細胞進行電生理記錄。將內充電極內液的玻璃微電極與細胞封接、破膜，形成全細胞記錄模式(環境溫度22~25℃)，放置5min以上以確保微電極內的電極內液與細胞質混合均勻。標準的細胞內外液將被用于所有的試驗，在記錄的細胞外液添加5μmol/L硝苯地平阻斷Ca2+通道。使用電腦程序調控誘發電位并捕捉電流信號(經2kHz過濾處理)。樣本信號取自4kHz經12位分辨率數模轉換器轉換，然后儲存在電腦中。刺激方案：①通過計算機發放電壓2mV、脈寬10ms的連續刺激脈沖補償電容電流；②保持電位–80mV、100ms預脈沖到–60mV失活快鈉通道；③Ito刺激脈寬為500ms，刺激電壓范圍為–40mV~+60mV，階躍10mV，頻率0.2Hz；④Ito幅值取+60mV時電流峰值。每次測試脈沖所產生的Ito電流振幅(外向電流峰電位與去極化電流末期的穩定電位之差)均加以記錄。電流峰值除以被記錄細胞電容大小為該心肌細胞的電流密度，單位為pA/pF。

在顯微鏡下選用形態良好的心肌細胞進行電生理記錄，在標準的全細胞膜片方案電壓鉗模式下對對照組及DM組大鼠的心肌細胞進行刺激，應用軟件(Pulse/PulseFit，V.8.11，HEKA Elektronik)采集Ito數據，記錄電流圖，計算Ito密度(單位：pA/pF)，對照組成功獲得16個心肌細胞Ito電流圖(對照組，n=16)，DM組成功獲得17個心肌細胞Ito電流圖(DM組，n=17)，觀察DM對大鼠心肌細胞Ito密度的影響。

1.6 觀察JNK對DM大鼠心肌電生理的影響 在離體心肌中使用標準的全細胞膜片方案電壓鉗檢驗JNK激酶抑制劑對Ito的影響。DM大鼠心肌細胞經JNK抑制劑SP600125(10μmol/L)處理4~5h后，測量Ito密度，成功獲得18個此類DM心肌細胞Ito電流圖(DM+SP600125組，n=18)；將DM大鼠心肌細胞經膜滲透性蛋白抑制劑JNKI-1(10μmol/L)處理4~5h后，成功獲得10個此類DM心肌細胞的Ito電流圖(DM+JNKI-1組，n=10)；用無活性的膜滲透性蛋白抑制劑JNKI-Neg(10μmol/L)處理DM大鼠心肌細胞4~5h后，成功獲得7個此類DM心肌細胞的Ito電流圖(DM+JNKI-Neg組，n=7)。將得到的Ito密度值進行比較。

1.7 觀察TrxR抑制劑對DM大鼠心肌的Ito電流強度的影響 為了檢驗Trx系統是否參與了JNK激酶對心肌Kv通道重構的調控，采用TrxR抑制劑金諾芬(AF，10nmol/L)對DM大鼠心肌細胞進行4~5h處理再測量Ito密度，成功獲得13個此類DM心肌細胞的Ito電流圖(DM+AF組，n=13)，與未經AF處理的對照組(n=16)Ito密度進行比較；應用AF對經SP600125處理過的DM大鼠心肌細胞進行4~5h處理后再測量Ito密度，觀察處理前后Ito密度的變化，成功獲得15個此類DM心肌細胞的Ito電流圖(DM+SP600125+AF組，n=15)，觀察TrxR對JNK的影響。對照組大鼠心肌細胞分別應用AF和SP600125進行4~5h處理后測量Ito密度，觀察處理前后Ito密度的變化，分別成功獲得18個和12個對照組心肌細胞的Ito電流圖(對照+SP600125組，n=18：對照+AF組，n=12)，觀察二者對正常心肌的影響。

1.8 Western blotting法檢測Kv4.2含量 檢測JNK抑制劑SP600125對Kv4.2(Ito電流的主要亞基)表達的影響。將灌流消化后的左室心肌組織樣本放入低溫、已加入蛋白酶抑制混合物的TE緩沖液中并搖勻，置于離心機離心(1000×g，10min)以除去細胞核和碎片，然后再次將顆粒懸浮于TE緩沖液中，重新搖勻并離心。將兩次低速離心的上清液融合并高速離心(40 000×g，15min)，將沉淀的顆粒重新懸浮于TE緩沖溶液(已加入600mmol/L碘化鉀以去除心肌蛋白)，之后重新高速離心(40 000×g，10min)。將沉淀顆粒用TE溶液洗2次，溶解于含2%Triton X-100的TE緩沖液中并冷凍1h。之后將不溶物利用高速離心(15 000×g，15min)去除。留取對照組和DM組左室心肌組織樣本，各分為8份，然后將兩種樣本各取出4份，分別經SP600125(10μmol/L)處理4~5h，則得4種樣本各4份(對照組、DM組、對照+SP600125組、DM+SP600125組)，將所有檢測樣本蛋白質等量行SDS-PAGE，然后轉膜至聚偏氟乙烯膜。使用含有5%脫脂奶粉的商業緩沖液(Pierce，Rockford，IL)室溫封閉1h。使用抗Kv4.2抗體(Alamone Labs，Tel Aviv，Israel)對Kv4.2的含量進行檢測。采用高級免疫印跡觀測設備(GE Healthcare，Piscataway，NJ)對結果進行觀測，使用UVP生物成像系統進行分析，并使用多測量軟件(FujiFilm，Valhalla，NY)對結果進行量化，所得數據進行比較。

1.9 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。計量數據均以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 DM大鼠心肌細胞JNK活性的檢測 與對照組相比，DM組磷酸化JNK(p-JNK)含量明顯升高(左室：2.2±0.4倍；室間隔：2.0±0.2倍；圖1)。

2.2 DM對大鼠心肌細胞Ito密度的影響 全細胞膜片鉗記錄結果顯示，0~60mV時，DM組大鼠心肌細胞Ito密度均明顯低于對照組(P<0.05，圖2)。

圖1 DM大鼠心臟JNK活性(Western blotting)Fig.1 JNK activity of diabetic rat heart (Western blotting)

圖2 糖尿病對大鼠心肌細胞Ito密度的影響Fig.2 Effect of diabetic on Ito density of cardiomyocytes in rats

2.3 JNK對DM大鼠心肌電生理的影響 結果顯示，JNK抑制劑SP600125明顯增加了Ito電流密度(圖3A)。DM+SP600125組的Ito電流密度(60mV時)為32.3±3.7pA/pF，與DM組(15.3±2.1pA/pF)比較明顯增強(P<0.05，圖3B)。DM大鼠心肌經膜滲透性蛋白抑制劑JNKI-1(10μmol/L)處理后，Ito密度也明顯增加(DM+JNKI-1組：28.6±3.1pA/pF)，而經無活性的膜滲透性蛋白抑制劑(JNKI-Neg，10μmol/L)處理后Ito密度無明顯改變(DM+JNKI-Neg組：15.8±2.4pA/pF)。

圖3 JNK抑制劑對Ito密度的影響Fig.3 Upregulation of Ito density by JNK inhibitors

2.4 TrxR抑制劑對DM大鼠心肌Ito密度的影響為了檢驗硫氧還蛋白系統是否參與了JNK激酶對心肌Kv通道重構的調控，本研究檢測了TrxR抑制劑AF對DM大鼠心肌Ito密度的影響，結果顯示，AF明顯抑制了SP600125對DM大鼠心肌Ito的增強作用(DM+SP600125+AF組：15.7±3.3pA/pF；DM+SP600125組：32.3±3.7pA/pF；P<0.05)，而AF對對照組Ito無明顯影響(對照組：30.2±3.3pA/pF；對照+AF組：31.9±3.5pA/pF)。此外，DM組中的SP600125處理組最大Ito密度(DM+SP600125組：32.3±3.7pA/pF)與對照組(30.2±3.3pA/pF)比較差異無統計學意義。且對照組經SP600125或SP600125+AF處理后的最大Ito密度(對照+SP600125組：31.6±3.4pA/pF，對照+SP600125+AF組：31.2±3.7pA/pF)與未經處理的對照組差異無統計學意義(表1)。

2.5 JNK抑制劑對Kv4.2表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，與對照組相比，未經處理的DM大鼠心肌(DM組)Kv4.2蛋白豐度明顯降低(P<0.05)。但經SP600125處理后，盡管未完全恢復到對照組水平，DM+SP600125組心肌的Kv4.2蛋白表達量與DM組比較明顯增加(P<0.05)。對照組經SP600125處理后，Kv4.2蛋白表達無明顯變化，與先前在DM心肌所觀察到的Ito電流改變一致(圖4)。

表1 AF對DM大鼠心肌Ito密度的影響(±s，pA/pF)Tab.1 Effect of AF on Ito density of cardiomyocytes in DM rats (±s, pA/pF)

表1 AF對DM大鼠心肌Ito密度的影響(±s，pA/pF)Tab.1 Effect of AF on Ito density of cardiomyocytes in DM rats (±s, pA/pF)

AF. Auranofin; (1)P<0.05 compared with DM group; (2)P<0.05 compared with DM+SP600125 group

Group –40mV –20mV 0mV 20mV 40mV 60mV Control (n=16) 0.2±0.1 1.2±0.3 6.4±0.9 16.0±1.9 24.8±2.8 30.2±3.3 Control+SP600125 (n=18) 0.2±0.1 1.3±0.2 6.5±1.1 16.4±1.8 25.6±2.9 31.6±3.4 Control+AF (n=12) 0.2±0.1 1.3±0.3 6.2±0.7 16.2±2.0 25.3±3.1 31.9±3.5 Control+SP600125+AF (n=12) 0.2±0.1 1.2±0.3 6.6±0.9 14.9±1.6 24.5±3.0 31.2±3.7 DM (n=17) 0.2±0.1 0.6±0.2 3.5±0.6 8.2±1.2 12.1±1.9 15.3±2.1 DM+SP600125 (n=18) 0.2±0.1 1.2±0.3(1) 6.5±0.8(1) 15.3±1.4(1) 24.3±3.2(1) 32.3±3.7(1)DM+AF (n=13) 0.2±0.1 0.7±0.2 3.5±0.5 9.1±0.9 12.5±1.7 15.1±2.3 DM+SP600125+AF (n=15) 0.2±0.1 0.6±0.2(2) 3.7±0.6(2) 9.2±1.1(2) 13.1±1.6(2) 15.7±3.3(2)

圖4 SP600125對DM大鼠心肌Kv4.2蛋白表達的影響Fig.4 Upregulation of DM myocardial Kv4.2 protein expression by SP600125

3 討 論

DM可引起心肌電重構，表現為ECG異常和多種Kv變化[1]。在嚙齒類動物心肌中，由疾病所致Kv通道的減少會導致動作電位時程(APD)異常延長和不應期改變[8]。APD由細胞內、外向各種離子通道電流相互之間的精確平衡所控制，心肌細胞膜內向離子電流的增加和(或)外向電流的減少都會延長APD及QTc間期。細胞膜上的Ito是心肌細胞動作電位(AP)復極的主要電流，Ito的降低不僅導致APD延長，還會致使Ca2+調節障礙及收縮減弱，影響心肌的APD及興奮、收縮和傳導功能，ECG可出現QTc間期、QRS時限、ST段水平、T波形態等的改變，繼而影響心臟的功能，出現左心室縮短分數(LVFS)和左心室射血分數(LVEF)下降[3]。而APD、QRS波時限和QTc間期延長均易導致心律失常的發生[9]。然而，引發Kv通道表達及Ito密度下降的細胞機制尚未完全明了。

研究發現，氧化應激在DM及其心血管并發癥中發揮著重要作用，尤其是在心肌離子通道Kv4的重構中起著關鍵作用，DM誘導的心律失常和心室功能障礙常與氧化應激損害密切相關[3,9-10]。在高糖環境下，人體內環境中的各種氧化物質濃度升高，抗氧化物質的抑制因子增多，常出現Trx-1分子表達不足，導致機體抗氧化能力降低，從而引起細胞內氧化應激水平明顯升高[9]，其主要機制是發生在含有半胱氨酸的巰基蛋白質上的可逆性氧化修飾[11]，此類蛋白中包含大量維持細胞穩態的調控信息，可影響細胞膜離子通道的功能。Trx系統和Grx系統作為重要的內源性巰基轉移酶，是心肌細胞內氧化還原調控的主要組成部分，通過催化蛋白質中巰基二硫鍵的轉換反應，保持細胞內高濃度的還原型谷胱甘肽(GSH)，發揮解毒功能，使蛋白質處于還原狀態[12]，維持細胞膜的完整性。當活性氧類(ROS)水平明顯升高和(或)氧化還原酶系統受損時，蛋白質發生氧化或蛋白質與氧化還原分子相互作用發生改變，最終可導致細胞的生理功能改變。雖然目前已明確氧化還原酶系統的一項重要功能是參與細胞的自我修復，以保護細胞蛋白不受氧化損傷，但其調節心臟電生理表型的分子機制仍不明確。因此，本研究利用DM大鼠模型探尋Trx系統調節Kv通道重構的機制，結果表明，在DM心肌中，細胞凋亡信號調節通路中JNK是Trx-1的重要結合物，而持續激活的JNK可降低Kv通道表達。

JNK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的成員之一，它是細胞外界信號由細胞表面轉導到細胞核內部的重要傳遞者[13]。大量的基礎研究證實，JNK信號通路參與了細胞增殖與分化、細胞形態維持、細胞骨架構建、細胞凋亡和細胞惡變等多種生物學反應，主要通過JNK磷酸化蛋白的表達來調控相關反應[14]。高糖環境可誘導JNK1磷酸化，進而影響下游TRPC6信號表達，使膠原蛋白沉積過多，導致心肌細胞肥大和纖維化[15]。SP600125是ATP競爭性的JNK高選擇性抑制劑，可作用于JNK1、JNK2和JNK3，明顯抑制JNK介導的MAPK激活。

應激激活的蛋白激酶(如JNK)是心肌肥厚及凋亡的ROS敏感調節因子[16]。DM狀態下JNK會受到刺激進而被激活，而這種激活可通過抗氧化治療而被抑制[6]。本研究結果顯示，這些激酶與心室Kv通道重構有關，DM心肌經過JNK抑制劑處理幾個小時后，可以增加Ito密度。

研究證實Kv電流(尤其是Ito)強度降低是多種疾病狀態下心室電重構的標志[17]，且在大鼠心衰模型中氧化應激和氧化還原酶活性損傷在Kv4通道表達下降及Ito密度降低中具有關鍵作用[11-12]。本實驗室已證實在1型糖尿病[6]或慢性心肌梗死[3]中，Trx系統對調節Kv4通道及Ito密度具有重要作用。

本實驗室檢測到在糖尿病中心室電重構的標志Ito密度下降可以恢復[3]，這一過程稱為去重構。在DM心肌中，JNK激酶可以一種TrxR依賴性的方式激活去重構。這些結果表明JNK信號通路可激活DM心肌中的Trx系統，且本研究進一步證實這種激活與TrxR相關，因為JNK激酶抑制劑明顯增加Ito通道電流的作用能被TrxR抑制劑所阻斷。

現有資料表明，ASK1是慢性心衰中Ito重構的另一關鍵性氧化還原敏感調節因子[18-19]。ASK1是一種促分裂原活化蛋白激酶，可以激活JNK并受氧化應激特異性調節，ASK1可以與還原型Trx1直接結合，這會降低ASK1的活性[20]。在某些細胞中還原型Grx1也可以與ASK1結合，進而降低ASK1活性。這可能是由于在ROS條件下，Trx1發生氧化，進而釋放ASK1，因此ASK1活性增強，對JNK的磷酸化作用也隨之增強[5-6]。本研究結果表明，在DM心肌中，Kv4.2通道表達降低與由ASK1所介導的JNK活性增強相關。JNK抑制劑并未明顯改變對照組心肌Kv4.2蛋白的豐富度，這也與先前所觀察的電生理改變一致。

總之，DM對大鼠心肌細胞的Ito密度有明顯影響。DM大鼠左室心肌細胞Trx系統功能下降，蛋白質氧化水平增高，使心肌細胞Ito密度明顯下降，這些是導致心室功能降低和心律失常發生的電生理基礎，而胰島素能夠逆轉DM大鼠心肌細胞Ito的下降[3]。本研究結果表明，Kv通道受氧化還原狀態調節，慢性Trx系統損傷可以通過持續激活ASK1-JNK信號通路而促進Ito電流重構。在DM心肌中，IGF-1可激活受體酪氨酸激酶信號通路，進而抑制ASK1-JNK活性，并通過一種TrxR依賴性途徑增加Kv4通道。因此，對于由心電重構及DM所致的心律失常，Trx系統可能是一個新的治療靶點。

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