外周血間充質干細胞聯合可吸收明膠海綿-自聚合肽修復大鼠股骨髁缺損

張志明 劉椿 伍國鋒 曹延林 金揚磊 王一涵 郭家松 朱立新

1南方醫科大學第二附屬醫院（珠江醫院）骨科中心（廣州510280）；2荊州市第一人民醫院（長江大學第一附屬醫院）骨科（湖北荊州434000）；3南方醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室（廣州510515）

盡管傳統的治療大塊骨缺損的方法如自體骨移植、同種異體骨移植等取得了較好的臨床效果，但這些方法均不同程度地存在一定缺陷，如自體骨移植來源困難、供區長期慢性疼痛，同種異體骨移植具有無法避免的免疫排斥反應及長期服用免疫抑制劑所帶來的并發癥等［1］。因此，研制一種具有高效、低副作用的骨缺損修復材料具有重大的臨床價值。骨組織工程作為近年來治療骨缺損的方法之一，與傳統技術相比，具有取材來源廣泛，不易引起排異反應等優點，因而成為從事骨組織工程研究的學者們近年來研究的熱點［2］。雖然目前骨組織工程研究有了很大的進展，但是若將其廣泛用于臨床，仍有很多問題急需解決。如何獲取合適的種子細胞和支架材料仍舊是骨組織工程研究的重點。因此，本研究以外周血間充質干細 胞（peripheral blood mesenchymal stem cells，PBMSCs）為種子細胞，多孔明膠海綿（absorbable gelatin sponge，AGS）、自聚合肽（self assembling peptide，SAP）的復合物為新型支架材料，使PBMSCs在AGS/SAP復合支架材料中的微環境類似于體內真實的三維生長環境，并且研究該新型復合組織工程材料在修復大鼠股骨髁骨缺損中的實際效果，為骨組織工程進一步發展提供新思路，為骨組織工程臨床應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑SAP（Corning）；AGS；雌性SD大鼠，體質量200～300 g（南方醫科大學實驗動物中心）；青霉素鈉［北京悅康凱悅制藥有限公司，0.48 g（80 萬 U）/支］，戊巴比妥鈉（Sigma），EDTA脫鈣液（LEAGENE）。

1.2 研究方法

1.2.1 多孔可吸收明膠海綿的制備由本研究團隊所在醫院骨科中心提供，將多孔可吸收明膠海綿制作成直徑4.0 mm、高5.0 mm的圓柱狀。采用的消毒方式如下：95%、75%酒精依次浸泡30 min，PBS洗滌3次，紫外線照射下自然干燥后無菌條件下密封保存備用。

1.2.2 PBMSCs的分離及培養以文獻所述方法［3］分離、培養人體外周血干細胞的方法為參考，分離SD大鼠外周血間充質干細胞，調節細胞濃度為6×106個/mL并接種于3 cm培養皿中，置于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養，待貼壁細胞融合度達80%左右，用0.05%胰蛋白酶消化傳代培養。

1.2.3 PBMSCs的鑒定、體外多向誘導及染色、在復合支架材料中成骨誘導取P3 PBMSCs進行流式細胞術鑒定外周血來源的間充質干細胞的細胞表型。同時進行多向誘導染色。將PBMSCs接種于爬片上，分別加入成骨、成脂誘導液，每孔300 μL，每3天換液1次，連續誘導14 d，進行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、油紅O（oil red O，ORO）染色觀察。同時用P3 PBMSCs構建體外AGS/SAP/PBMSCs培養模型。成骨誘導21 d，多聚甲醛固定，冰凍切片后進行骨鈣蛋白、DAPI染色觀察。

1.2.4 股缺損模型的制備及材料植入按文獻報道［4］的方法在分組后的SD大鼠左側股骨髁制備直徑4 mm，深度為5 mm的缺損模型，隨后按預先分組植入復合支架材料。術后予10萬U青霉素腹腔注射，1次/d，連續3 d。

1.2.5 影像學、組織學檢測術后12周取材，將標本進行X線檢查、Micro-CT掃描，觀察骨缺損修復情況，計算缺損區域的新生骨的骨密度（BMD）［5］。隨后徹底脫鈣，制備厚度為5 mm的石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染色，鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析，統計數據用均值±標準差表示，3組間影像學評分采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代細胞的形態、鑒定及誘導分化在原代培養皿中發現大量貼壁的長梭形細胞；傳代2次后，細胞形態均一（圖1A）。流式細胞術鑒定的結果（圖2）顯示，符合間充質干細胞的表型特點。PBMSCs成骨誘導染色結果顯示細胞廣泛表達ALP（圖1B）；PBMSCs成脂誘導后經ORO染色可見細胞內充滿大量的紅色脂滴（圖1C）。說明最后所得的細胞 是外周血 間充質干 細胞，且具 有多向分化的潛能 。AGS/SAP支架中PBMSCs經過21 d成骨誘導后 ，骨鈣蛋 白染色（ 圖3、4） 提示已經 有大量PBMSCs被成功誘 導為成骨 細胞，說 明AGS/SAP復合支架不 影響PBMSCs生長、成骨 分化，可 作為組織工程支 架材料。

圖1 PBMSCs形態、成骨與成脂誘導及鑒定Fig.1 Morphology of culture PBMSCs and identification of induced cells

圖2 流式細胞術鑒定PBMSCs表型Fig.2 Cell phenotypes of PBMSCs measured by flow cytometry

圖3 AGS、AGS/SAP支架及AGS/SAP/PBMSCs掃描電鏡觀察(scanning electron microscope,SEM)Fig.3 Structures of AGS scaffolds measured by SEM

圖4 PBMSCs在AGS-SAP支架中成骨誘導Fig.4 Cultured PBMSCs induced into osteoblasts in the AGS/SAP scaffolds

2.2 影像學檢查通過X線檢測（圖5），發現實驗組骨缺損處與正常股骨髁骨相近，而空白對照組和單純支架對照組仍可見明顯骨缺損；Micro-CT（圖6）可見實驗組（C1，C2）骨缺損基本修復，而空白對照組（A1，A2）和純支架對照組（B1，B2）仍可見大塊未修復的骨缺損存在。BMD結果（圖7）如下：空白對照組組為609.9±27.3，純支架對照組為647.3±33.7，實驗組為708.6±25.4，3組之間的差異有統計學意義（P＜0.01）。結合以上結果，說明AGS/SAP/PBMSCs具有較好的骨缺損修復效果，可以用于大鼠股骨髁缺損的治療。

圖5 骨缺損X片圖Fig.5 Bone defects been X-rayed

圖6 骨缺損Micro-CTFig.6 Bone defects scanned by Micro-CT

2.3 HE染色HE染色結果見圖8，空白對照組在股骨髁缺損周圍邊緣處有較少不規則新生骨組織形成，由邊緣向中心生長；純支架對照組骨缺損外圍存在部分新生骨，與骨組織類似，但在填充區域可見較多未降解的支架材料及散在極少量的骨組織細胞；骨缺損處新生骨組織與周圍正常骨組織相連。HE染色結果顯示，SAP/AGS復合PBMSCs可用于修復骨缺損的治療，經12周修復，缺損處的新生修復骨組織形態結構逐漸與周圍正常骨組織接近。

3 討論

利用骨組織工程修復各種原因所致的大塊骨缺損有很大前景。骨組織工程應具備三要素：種子細胞、支架材料和生長分化因子［6］。如何獲取合適的種子細胞是骨組織工程的首要環節，其次是制備具有機械性能高，生物相容性好，細胞毒性低的生物材料［7-8］。

圖7 各組BMD統計結果Fig.7 BMD statistical results of 3 groups

種子細胞應該具有取材容易、來源廣泛、易于體外擴增培養的特點。本研究采用PBMSCs作為種子細胞，不僅具備上述特征，而且對供者自身幾乎無不良影響，同時不涉及社會、道德倫理等方面的爭議。避免了其他干細胞，在獲取過程中所面臨的如組織損傷、局部感染和倫理道德等問題。因此PBMSCs有望成為一種新的、廣泛用于未來骨組織工程的種子細胞。

圖8 HE染色顯示各組骨缺損修復結果Fig.8 Regeneration of bone defects measured by HE stain

AGS是由明膠分子聚合而成的具有網絲狀微孔結構聚合物，AGS的微孔大小均勻、形狀規則，對小分子物質及細胞的吸附作用強，可以為細胞各項功能的發揮提供一個最佳的微環境，同時也能夠為骨的形成提供空間［9］。而且明膠海綿具有良好的組織相容性，可自行吸收，來源廣泛，取材方便的優點，目前已廣泛應用于臨床，尤其在骨科臨床手術中。自聚合肽納米纖維支架（self assembling peptide，SAP）遇鈣、鎂等離子立即立即自聚合形成的水凝膠具有低免疫源性、生物可降解性、納米復合性以及與細胞外基質高度相似性等特點［10］，同時可為細胞提供真實的三維生長環境，它已成功用于多種組織工程的研究［11-13］。

本研究采用的AGS/SAP/PBMSCs移植材料，通過對SD大鼠股骨髁缺損的修復實驗，證實了AGS/AP/PBMSCs對骨缺損具有較好的修復效果。它的成骨修復效果一方面與復合組織工程支架材料及PBMSCs有關，同時由于該支架材料改變了PBMSCs在支架中的生存環境，從而更接近于細胞的真實生存環境，進而更加有利于成骨細胞成骨；另一方面可能是由于細胞生存環境的改變，進一步激活了細胞的某種機制，從而進一步促進了成骨修復效果。

綜上所述，本課題組將AGS/SAP/PBMSCs植入SD大鼠股骨髁缺損，通過一系列檢測，發現AGS/SAP/PBMSCs比空白組、AGS/SAP組有更好的骨缺損修復能力。從而說明了基于AGS/SAP的三維立體支架材料復合PBMSCs，更能有效促進SD大鼠股骨髁缺損的修復，為臨床上骨缺損修復提供新的思路及實驗依據。但本研究的不足之處在于，未對因細胞生長微環境的變化而導致的細胞機制的相應變化進行深入的研究，這將是我們后期研究的重點。

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