甲狀腺癌基因檢測在甲狀腺結節(jié)早期診斷中的臨床應用

張紅梅 周紅燕 汪佩 喻佛定 王娟娟 易蘭

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院內(nèi)分泌科（武漢 430015）

甲狀腺結節(jié)和甲狀腺癌（thryoid cancer）是內(nèi)分泌系統(tǒng)的多發(fā)病和常見病。傳統(tǒng)超聲檢查以其無創(chuàng)性、無放射性，已成為甲狀腺疾病的首選輔助檢查。彩色多普勒超聲根據(jù)甲狀腺結節(jié)大小、形態(tài)、周圍及內(nèi)部的血供、內(nèi)部回聲類型及分布、邊界、有無鈣化等各種特征，來判斷其良惡性，但國內(nèi)外學者均認為單獨一個特征不能很好地鑒別結節(jié)的良惡性，即使結合目前興起的超聲彈性應變率檢測，仍存在一定的主觀性［1］。甲狀腺細針穿刺抽吸活檢（FNAB）被認為是術前鑒別診斷的最佳指標，但仍有10%～30%不能明確診斷，研究證實，60%～70%的甲狀腺癌存在至少一種分子遺傳學改變，而這些分子遺傳學改變可作為潛在的分子標志物，用于臨床診斷、危險分級、療效及預后預測［2］。目前國內(nèi)外診療指南均推薦：經(jīng)FNAB不能確診的甲狀腺結節(jié)，可行甲狀腺癌分子標記物檢測［3］，但其循證醫(yī)學證據(jù)尚不充足，我們的研究擬對甲狀腺結節(jié)術前行FNAB聯(lián)合分子診斷及彩色超聲聯(lián)合檢測分析，探討其對甲狀腺癌早期診斷的臨床意義，為甲狀腺結節(jié)的規(guī)范化治療提供循證醫(yī)學證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對象選取2015年1月到2016年5月在華中科技大學武漢市中心醫(yī)院行甲狀腺全切或次全切的患者61例，納入標準：均為術前同意行甲狀腺細針穿刺抽吸活檢及癌基因分子診斷檢測項目，首次入院行手術治療，術后行病理組織學檢查，有完整的病理描述資料的患者。排除標準：既往曾患有甲狀腺功能性疾病并服用藥物治療者、既往有甲狀腺手術史、凝血機制異常者、有甲狀腺癌家族史者。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，受試者均按自愿原則，簽署知情同意書。

1.2 方法本研究為回顧性分析研究，所有病例按術后病理檢查結果分為：良性甲狀腺結節(jié)組和甲狀腺惡性腫瘤組?；仡櫺苑治龌颊呷丝趯W特征及FNAB、甲狀腺癌基因檢測及彩色超聲特征。各項指標檢測方法如下：

1.2.1 彩色超聲檢查使用飛利浦IU22彩色多普勒超聲診斷儀（荷蘭皇家飛利浦電子集團生產(chǎn)），探頭型號：L12-5 Linear Probe，探頭頻率為5～12 MHz?；颊呷⊙雠P位、墊肩，頸部過伸，充分暴露頸前區(qū)，常規(guī)行多切面掃查，仔細觀察并記錄病灶大小、質地、邊界、縱橫比是否＞1、內(nèi)部回聲是否均勻及有無鈣化，病灶周圍和內(nèi)部血流情況等，并常規(guī)掃查頸部淋巴結有無腫大。

1.2.2 FNAB所有患者術前進行血常規(guī)及凝血功能檢查。超聲引導下細針穿刺，抽取組織液送檢細胞學及癌基因分子診斷?；颊呷⊙雠P位，墊肩，頸部過伸，充分暴露頸前區(qū)，超聲引導應用高頻線陣探頭，頻率12 MHz，對甲狀腺進行常規(guī)檢查的同時消毒頸前區(qū)，2%利多卡因局部麻醉手術部位，將穿刺針（23 G*8 cm）于超聲定位點進針，不接負壓裝置，在5 s內(nèi)變換不同針道進行反復提插，再用超聲實時觀察進針點，全程監(jiān)視穿刺針方向和位置，到達病灶區(qū)，吸出組織液注于載玻片上，病理科醫(yī)師實時涂片染色并在顯微鏡下評估細胞。穿刺部位棉球壓迫15 min。

彩色超聲檢查和FNAB兩種檢查結果分別由2位經(jīng)驗豐富的副主任醫(yī)師完成。

1.2.3 甲狀腺癌基因檢測細針穿刺物同時送武漢康圣環(huán)球醫(yī)學檢測集團，運用miRInform分子檢測及Luminex液態(tài)芯片技術，檢測FNAB樣本中BRAF基因點突變、RET/PTC重排、Pax8/PPARγ重排和RAS基因點突變。

1.2.4 病理學檢查結果所有病例都對術中探查發(fā)現(xiàn)的每一個甲狀腺結節(jié)進行冰凍病理切片檢查，手術后再進行石蠟切片核實。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0和MedCalc15.0軟件進行統(tǒng)計學分析。分析流程是：（1）2組基線特征統(tǒng)計分析，對計量資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用t檢驗，以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗以百分率表示；（2）用KAPPA值檢驗不同檢測方法的診斷一致性；（3）以術后病檢結果為因變量，各項臨床特征為為自變量建立甲狀腺癌Logistic回歸模型；（4）用病檢結果為金指標，用ROC曲線計算甲狀腺癌預測概率和病例診斷的診斷閾值、靈敏度和特異度。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較61例甲狀腺結節(jié)患者，平均年齡（44.97±12.05）歲，其中女50人，占82%，男10人，僅占18%，良性甲狀腺結節(jié)組31人，占50.8%，惡性結節(jié)組30人，占49.2%，其中29例均為微小乳頭狀癌，1例為濾泡狀癌，兩組在年齡和性別分布上差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

2.2 兩組FNAB結果比較惡性組的陽性檢出率為70%，良性組陰性檢測率為93.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P值為0.000）。

2.3 兩組甲狀腺癌基因突變檢測結果比較惡性組有24例基因突變陽性病例，占80%，均為BRAF基因c.1799T＞A突變，導致氨基酸發(fā)生p.Val600Glu改變，未見RET/PTC1及RET/PTC3改變，而良性組的陰性率為96.8%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P值為0.000）。

2.4 FNAB和癌基因檢測診斷的一致性經(jīng)KAPPA檢驗二者的診斷一致性指數(shù)為0.73，一致性較好，且有統(tǒng)計學差異。

2.5 兩組在彩色超聲特征上比較結節(jié)大小比較，良性組＜1 cm的有29人，占93.5%，惡性組＞1 cm的有9例，占31.0%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P值為0.02）；結節(jié)為低回聲的在惡性組有26例，占86.7%，良性組有17例，占54.8%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P值為0.011）；兩組在結節(jié)質地、鈣化與否、結節(jié)個數(shù)、周邊血流、縱橫比、周圍淋巴結是否腫大等特征方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.6 以術后病檢結果為因變量，各項臨床特征為為自變量建立甲狀腺癌Logistic回歸模型結果顯示：與甲狀腺癌診斷相關的指標依次為癌基因檢測、結節(jié)大小、低回聲和細針穿刺細胞學，且只有癌基因檢測對甲狀腺結節(jié)性質的診斷有統(tǒng)計學意義（表2），其回歸方程為：

表1 甲狀腺結節(jié)良性組和惡性組的臨床特征比較Tab.1 The comparison of clinical features between benign thyroid nodules group and malignant group 例（%）

表2 非條件Logistic回歸分析結果Tab.2 The results of the non-conditional logistic regression analysis

2.6 由ROC曲線下面積判斷臨床指標價值與甲狀腺癌顯著相關的診斷指標及其AUC分別是：癌基因檢測0.915（95%CI：0.814 ～ 0.971）、細針穿刺細胞學 0.813（95%CI：0.691 ～ 0.902）、低回聲0.657（95%CI：0.523 ～ 0.775）、結節(jié)大小0.623（95%CI：0.488 ～ 0.745），聯(lián)合診斷模型AUC為0.957（95%CI：0.871～0.993），所建的聯(lián)合診斷模型價值最高，其靈敏度為93.1%，特異度為90.3%，最佳診斷點為0.134 1，即通過模型計算病例的惡性概率，如果惡性概率≥0.134 1，則認為該病例的甲狀腺結節(jié)為惡性（圖1）。

圖1 聯(lián)合診斷模型預測概率與甲狀腺結節(jié)性質的ROC曲線Fig.1 The ROC curve of the predictive probability of combined diagnostic model and the properties of thyroid nodules

3 討論

在過去的幾十年里，隨著TC的全球發(fā)病率迅速上升，發(fā)達國家TC的年齡標化發(fā)病率女性升至9.1/10萬，男性為2.9/10萬［4］。TC的高發(fā)生率及甲狀腺結節(jié)的過度手術已引起醫(yī)學界的廣泛關注［5］，當超聲或查體檢測出甲狀腺結節(jié)后，如何診斷其良惡性成為指導下一步治療的關鍵。

隨著甲狀腺超聲的逐漸普及，以及我國碘營養(yǎng)狀態(tài)從缺碘走向富碘，TC的流行病學特點發(fā)生了明顯變化，如分化型甲狀腺癌增加，濾泡型甲狀腺癌減少，微小癌明顯增多［6］，且女性占比遠高于男性，本研究顯示：甲狀腺結節(jié)患者中女性占比82%，，惡性結節(jié)組30例中，29例均為微小乳頭狀癌，1例為濾泡狀癌，與國內(nèi)外流行病學資料一致［7］，在這部分術前行FNAB和甲狀腺癌基因檢測的61例中，TC的百分比為49.2%，二者的診斷一致性較好，這一結果提示FNAB和癌基因分子標記物檢測對術前診斷的重要性。本研究中癌基因檢測的敏感度均達91.5%，高于FNAB細針穿刺細胞學（81.3%）、低回聲（65.7%）和結節(jié)大?。?2.3%），且癌基因檢測的特異性高達96.5%，F(xiàn)NAB為93.5%，如果聯(lián)合癌基因檢測、FNAB、超聲特征診斷敏感性提高到93.1%，特異性為90.3%。高于國內(nèi)其他研究者聯(lián)合FNAB和分子檢測［8］，從此可以看出：雖然FNAB作為評估甲狀腺結節(jié)性質，指導治療決策的“金標準”，被國內(nèi)外指南所推薦［3］，但癌基因分子標記物的檢測其特異性和敏感性更高，如果結合FNAB和彩色超聲檢查，有助于進一步在術前明確結節(jié)性質，減少不必要手術。

在PTC和FTC中，有4種突變類型被認為是最主要的突變，對腫瘤的診斷和預后意義重大，分別是：BRAF點突變基因、RET/PTC重排、Pax8/PPARγ重排和RAS點突變基因。BRAF基因突變在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用機制是研究的熱點，其參與RAS-RAF-有絲分裂原活化蛋白（MEK）-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑的信號傳導。BRAF基因第15外顯子上的T1799A突變導致BRAF蛋白產(chǎn)物的600殘基中的纈氨酸被谷氨酸替代（V600E），因而引起了MAPK通路中REK和MEK的腫瘤基因的級聯(lián)激活反應，導致細胞無限制分裂、增殖、腫瘤形成［9］。V600E點突變是BRAF基因中最常見的遺傳病變，約占PTC的45%。BRAF基因突變作用機制可能還與一些重要的腫瘤因子（金屬蛋白酶組織抑制因子3，死亡相關蛋白激酶等）的甲基化有關［10］，也可能通過促進 NF-κB［11］及 VEGF 的表達［12］，促進血管生成，腫瘤侵襲和轉移等。因而許多學者提出對BRAF陽性者治療上需要施行甲狀腺全切術加中心淋巴結清除，術后需要更高劑量的放射性碘治療，更低的促甲狀腺激素抑制。

研究發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合檢測多個分子標記物比單一標志物有更大的診斷意義。細胞學病理診斷為惡性腫瘤的標本，最后組織學病理證實惡性率為40%，而如果是檢測多個分子標記物，在突變陽性的標本中惡性率達到100%，而在突變陰性的標本中約有14%為惡性。分子檢測能將細胞學檢測假陰性率由2.1%降至0.9%。

在我們的研究中，有6例FNAB結果為陰性，而病檢結果為陽性，其中4例癌基因檢測發(fā)現(xiàn)有BRAF基因突變，推測其與細針穿刺所取組織細胞有限，而分子診斷能很好彌補FNAB的不足，進一步提高甲狀腺癌的術前診斷準確率，我們的研究發(fā)現(xiàn)開展分子診斷的不足之處在于：能接受穿刺的人群比例較低，需加強對甲狀腺結節(jié)患者的宣教，另檢測費用偏高，如果能進一步改進檢測技術，降低檢測成本，分子診斷有可能發(fā)展為常規(guī)檢測方法，從而為現(xiàn)代甲狀腺癌的診斷和治療策略提供有力的依據(jù)。

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