甲狀腺乳頭狀癌中PRL-3表達與腫瘤相關(guān)巨噬細胞及淋巴管生成的相關(guān)性

孫振華 蔣華平 陶文華

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1甲乳外科，2頭頸外科，3中醫(yī)腫瘤科（江蘇鎮(zhèn)江212000）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺疾病中最常見的惡性腫瘤類型，其發(fā)病率近年來有上升的趨勢，早期易發(fā)生淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移［1-3］。研究［4-5］表明，腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細胞在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的進程中發(fā)揮了重要的作用，微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor associated macrophags，TAMs）中可以有表型的變化，產(chǎn)生促使腫瘤生長的能力。而肝再生磷酸酶3（phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3）作為具有促進細胞增殖、遷移和侵襲的蛋白酪氨酸磷酸酶，在PTC中高表達，且與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［6-8］。本研究擬檢測PTC中PRL-3、TAMs標(biāo)志物CD68和淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40的表達，分析PRL-3表達與TAMs及淋巴管生成的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院甲乳外科2014年1月至2017年6月部分PTC手術(shù)切除病理標(biāo)本70例，其中男24例，女46例；年齡22～68歲，中位年齡46.5歲；有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。另取20例甲狀腺腺瘤組織作為良性疾病對照組。

1.2 試劑及方法PRL-3、CD68和D2-40蛋白表達用SP免疫組織化學(xué)法檢測。免抗人PRL-3多克隆抗體購自英國Abcam公司，鼠抗人CD68單克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體及SP試劑盒均購自北京中杉公司。陽性對照使用已知陽性切片，陰性對照用PBS代替一抗，按試劑盒說明書進行檢測。

1.3 切片免疫組化結(jié)果根據(jù)陽性細胞百分比及染色強度評分判定，依照陽性細胞比例：＜5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%、＞75%分別得0分、1分、2分、3分、4分；依照顯色強度：未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別得0分、1分、2分、3分；將兩項得分相乘得到該視野的最終得分，選取的5個視野得分的平均值為最后得分。最后該切片按照得分為以下四個等級：0～1分為（-），2～4分為（+），5～7分（++），≥8分（+++），++以上為陽性表達［9-10］。D2-40標(biāo)記的淋巴管數(shù)目計數(shù)參照Weidner標(biāo)準(zhǔn)。低倍鏡（×40）下選取密度較高淋巴管區(qū)域，然后在高倍鏡（×200）下5個高倍視野計數(shù)被染色的淋巴管數(shù)，染成棕色的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇計為一個淋巴管，取其平均值作為淋巴管密度（LVD）［11］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)有差異。相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，連續(xù)變量采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRL-3、CD68和D2-40在PTC及甲狀腺腺瘤中的表達PRL-3陽性表達定位于腫瘤細胞的細胞漿和細胞膜，PTC、甲狀腺腺瘤中PRL-3蛋白的陽性表達率分別為64.3%和15.0%，二組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CD68陽性表達定位于TAMs的細胞漿和細胞膜，主要是細胞漿。PTC中TAMs的密度高于甲狀腺腺瘤中的密度（P＜0.01）；D2-40在PTC組織中的表達水平高于在甲狀腺腺瘤組織中的表達水平（P＜0.01）。見表1。

表1 PRL-3、CD68和D2-40蛋白表達的比較Tab.1 Comparison of each protein expression between the two groups of specimens

2.2 PRL-3、CD68和D2-40表達與PTC病理特征的關(guān)系PTC組織中，PRL-3、CD68和D2-40的表達水平與患者年齡、性別及腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），但與淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.01）（表2，圖1）。Spearman相關(guān)性分析表明，PRL-3、CD68和D2-40三者表達水平呈現(xiàn)正相關(guān)性（P＜0.05）（表3）。

表2 PRL-3、CD68及D2-40與PTC臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relations of each protein expression with the clinicopathologic variables of papillary thyroid carcinoma patients

圖1 免疫組化（SP法）檢測PRL-3、CD68及D2-40蛋白的表達（×200）Fig.1 Immunohistochemical staining for PRL-3（A），CD68（B）and D2-40（C）expressions（×200）

表3 PRL-3、CD68及D2-40在甲狀腺乳頭狀癌中表達的相關(guān)性Tabl.3 The correlation among three proteins in papillary thyroid carcinoma

3 討論

PTC是甲狀腺疾病中最常見的腫瘤類型，其發(fā)病率近年來呈現(xiàn)上升趨勢，早期易發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而PRL-3是PRLs基因家族成員之一，是新近發(fā)現(xiàn)的蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，其分子結(jié)構(gòu)體現(xiàn)了雙重特異性磷酸酶的典型特征［12-13］。目前已經(jīng)證明某些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展與PRL-3關(guān)系密切，其作為靶點在腫瘤治療中的潛力已經(jīng)體現(xiàn)，但PRL-3在PTC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其分子機制未得到充分研究［14-16］。關(guān)于PRL-3誘導(dǎo)PTC微環(huán)境中巨噬細胞的募集和分化、促進PTC淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲的分子機制尚未見報道。本研究檢測PTC中的PRL-3、TAMs標(biāo)記物CD68和淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40的表達，并對性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小病理學(xué)特征進行分析，探討PRL-3在PTC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

PRL-3基因在腫瘤進展中的作用具有多效性，Al-Aidaroos等在多種人腫瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)了PRL-3誘導(dǎo)表皮生長因子受體（EGFR）的過度激活和級聯(lián)放大的下游信號［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，PTC組中PRL-3表達的陽性率為64.3%，高于其在甲狀腺腺瘤組中的陽性率15.0%（P＜0.05），提示PRL-3可能參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生過程。對于PTC而言，PRL-3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率為79.5%，高于其在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率45.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而其在性別、年齡、腫瘤大小分組中的表達水平無明顯差異（P＞0.05）。Spearman相關(guān)性分析后表明，PRL-3的表達與CD68、D2-40的表達水平呈正相關(guān)性（P＜0.05）。以上結(jié)果說明PRL-3的高表達可以促進TAMs的增殖和淋巴管生長，在PTC腫瘤的進展演進及淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用。

PTC最主要的轉(zhuǎn)移方式是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，約70%的患者發(fā)病時就可能合并區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究證實，TAMs主要是通過自分泌和（或）旁分泌途徑參與腫瘤淋巴管的生成［18］。研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的TAMs的功能狀態(tài)具有重要意義，而CD68是目前研究TAMs的特異性標(biāo)志物，檢測其表達水平可以了解TAMs的功能狀態(tài)［19-20］。本研究表明，CD68在PTC組中的陽性表達（71.8%）高于甲狀腺腺瘤組（20.0%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而在PTC組中，CD68陽性表達與年齡、性別及腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），但是其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率（87.2%）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（54.8%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明，CD68與D2-40的表達水平呈正相關(guān)，說明了TAMs不僅在PTC發(fā)生發(fā)展中起作用，而且也參與了腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的過程，其也可能作為甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后參考指標(biāo)。

某些具有轉(zhuǎn)移特性或血管侵襲性的腫瘤組織內(nèi)部淋巴管密度增加，這說明腫瘤內(nèi)部淋巴管既關(guān)系到腫瘤的局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后，還可能參與了腫瘤細胞的惡性演進［21］。D2-40的特點是可以特異性的標(biāo)記淋巴管，血管卻不被標(biāo)記，因此可以準(zhǔn)確的檢測組織淋巴管的密度［22］。本研究發(fā)現(xiàn)LVD在PTC組中的水平（11.26±5.12）高于甲狀腺腺瘤組（3.78±2.13），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而LVD密度在PTC組中與性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明PTC腫瘤組織中淋巴管的數(shù)量與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而淋巴管在數(shù)量上的增加，將會使腫瘤細胞進一步沿淋巴管的播散成為可能，這也是甲狀腺乳頭狀癌容易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的原因。

綜上所述，PRL-3在PTC中高表達，其表達水平與CD68、D2-40呈正相關(guān)性，三者在PTC的發(fā)生發(fā)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進程中發(fā)揮了重要的作用，而其中的分子機制有待進一步揭示。

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