基于環介導等溫擴增技術檢測江蘇省中部地區小麥赤霉病病菌的種群組成

許 苗，馮 慧，王淑琛，馬家新，葉文武，鄭小波

(南京農業大學植物保護學院/農業部作物病蟲害監測與防控重點開放實驗室，江蘇南京 210095)

小麥赤霉病是由鐮孢菌(Fusarium)的多個種引起的一種毀滅性病害。該病在我國主要發生于溫暖濕潤和半濕潤地區[1]，在長江中下游地區發生尤為嚴重，一般年份因該病害造成的小麥產量損失高達13%左右，嚴重時損失過半[2]。江蘇省是長江中下游重要冬麥區，其溫暖濕潤的氣候條件有利于病原菌在小麥揚花期侵入，導致小麥穗部發病，進而引起小麥赤霉病的流行。

不同國家或地區，引起小麥赤霉病的鐮孢菌種類有所不同。據報道，有17個種的鐮孢菌可引起小麥赤霉病，其中最主要的有5個種[3]。在中國有15個種的鐮孢菌是小麥赤霉病的致病菌，但是在一個省區一般只有一到數個種[4-7]，主要是亞細亞鐮孢(F.asiaticum)和禾谷鐮孢(F.graminearum)[8-10]。小麥赤霉病病菌的種群組成與地理分布有關，不同地區的主要致病菌種類因地理生態環境差異而有所不同[11]。Zhang等[12]研究發現，在引起中國小麥赤霉病的兩種主要致病菌中，亞細亞鐮孢主要分布在年平均氣溫高于15 ℃的溫暖地區，禾谷鐮孢則大多分布在年平均氣溫低于15 ℃的寒冷地區。徐 飛等[13]發現，禾谷鐮孢和亞細亞鐮孢是河南省小麥赤霉病的優勢種群；假禾谷鐮孢(F.pseudograminearum)、黃色鐮孢(F.culmorum)、木賊鐮孢(F.equiseti)和擬輪枝鐮孢(F.verticillioides)為次要種群。潘曉靜等[14]報道，引起東北地區小麥赤霉病的鐮孢有7個種，即禾谷鐮孢、藤倉鐮孢(F.fujikuroi)、燕麥鐮孢(F.avenaceum)、尖孢鐮孢(F.oxysporum)、木賊鐮孢(F.equiseti)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)和擬輪枝鐮孢(F.verticillioides)。Qiu等[15]和Dong等[16]報道，亞細亞鐮孢是江蘇省小麥赤霉病的主要致病菌，其次是禾谷鐮孢，但對該省赤霉病病菌的其他種類知之甚少。

傳統上對小麥赤霉病病菌的種群組成主要依據組織分離法進行病原菌鑒定，該方法對多病原病害的鑒定存在檢出率低且耗時、費力的缺點。隨著分子生物學技術的發展，分子檢測技術已成功應用于小麥赤霉病病菌種群組成與結構的分析[17-18]，使小麥赤霉病病菌種類檢測、鑒定較傳統方法更為快速準確，但這些檢測、鑒定方法依舊存在檢測周期長或特異性偏低等缺點。引起小麥赤霉病的鐮孢菌種類多，不同種類病原菌形態特征相似，所致病害癥狀相近，但不同種類鐮孢菌在發病麥穗組織中產生的毒素類型有差異[16,19-20]，基于環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立的特異性檢測技術[21]，具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、檢測時間短、結果可肉眼觀察判斷等優點。

本研究采用本課題組研發的可以分別特異性檢測7種小麥赤霉病主要病原菌的LAMP檢測技術，對江蘇省中部地區小麥赤霉病樣本進行檢測，旨在了解該地區小麥赤霉病致病鐮孢菌種類及其地理分布，并為小麥赤霉病病菌種群與結構分析提供新的技術。

1 材料與方法

1.1 小麥赤霉病樣本的采集

2017年5月上旬至下旬從江蘇省鎮江的句容市、揚州的儀征市和廣陵區、南京的江寧區和浦口區小麥田間采集帶有粉紅色霉層的小麥赤霉病樣本151份(1個病穗作為1份樣本)。病樣采集后分別用自封袋裝好，并編號，記錄采集地信息。

1.2 檢測的目標病原菌

檢測的7種病原菌均為小麥赤霉病的常見致病菌，包括亞細亞鐮孢、禾谷鐮孢、藤倉鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢、擬輪枝鐮孢和木賊鐮孢。

1.3 病穗組織DNA提取

每份樣本各取新鮮病穗上1～2個帶有粉紅色霉層的小穗，剪掉麥芒，于滅菌的研缽中加入液氮充分研磨，DNA提取采用中國北京天根公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒DNAsecure Plant Kit，方法參見說明書。提取的DNA作為LAMP檢測的模板，于-20 ℃保存。

1.4 小麥赤霉病病菌的LAMP檢測

7種目標病原菌的LAMP特異性檢測擴增條件、靈敏度及引物序列見表1和表2。所列7個LAMP檢測技術的反應體系為：2.5 μL 10×Thermo Pol Buffer，4 μL MgSO4(50 mmol·L-1)，4 μL betaine(5 mmol·L-1)，3.5 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，內引物FIP、BIP(20 μmol·L-1)各2 μL，外引物F3、B3(10 μmol·L-1)各0.5 μL，環引物 LF、LB(10 μmol·L-1)各1 μL，2 μL 羥基萘酚藍(hydroxynaphthol blue，HNB)(2.4 mmol·L-1)，1 μL Bst DNA 聚合酶(8 U·μL-1)，2 μL模板DNA，滅菌水補至26 μL。

以1.3節中提取的DNA為模板，按照上述LAMP反應體系分別進行7種病原菌的檢測，以相應病原菌標準菌株的DNA為陽性對照(藤倉鐮孢標準菌株為CBS183.29，其他6種鐮孢菌標準菌株參見表1對應參考文獻)，以ddH2O為陰性對照。擴增反應前加入羥基奈酚藍(HNB)為反應指示劑，反應結束后，通過肉眼觀察指示劑羥基奈酚藍顏色變化判定擴增結果，反應結束后產物呈天藍色為陽性，呈紫色為陰性。

表17種小麥赤霉病病菌的LAMP檢測技術體系

Table1LAMPassayusedfordetectingsevenFusariumspeciescausingwheatscab

檢測技術LAMP目標病原菌Objectivespecies擴增條件LAMPreaction靈敏度Sensitivity/(pg·μL-1)引物PrimerCYP51C?F．asia?LAMPF．asiaticum60minat63℃70[22]CYP51C?Fg?LAMPF．graminearum60minat62℃100[23]IGS?Ff?LAMPF．fujikuroi70minat62℃100表2Table2CYP51C?Fc?LAMPF．culmorum60minat63℃83[24]Esyn1?F．aven?LAMPF．avenaceum70minat63℃100[25]Pgk?Fv?LAMPF．verticillioides70minat62℃100[26]CYP51C?Fe?LAMPF．equiseti60minat62℃10[23]

表2用于檢測藤倉鐮孢的LAMP引物

Table2LAMPprimersusedforspecificdetectionofFusariumfujikuroi

目標病原菌Objectivespecies引物名稱Primername序列Sequence(5′→3′)藤倉鐮孢菌Ff?FIPTCAGCCTACCCTAGACCCTCGCCCTTACCTTTGCTTGAF．fujikuroiFf?BIPAGCTAGACTACTCTAAGGGTAGGTACAACTTCCACCAATTGCAFf?F3AGACACCGTTTTGTTTTGCFf?B3CTTTTCTCCAACTTCACAGCFf?LFATCCGGCCAAGACCGTC

1.5 小麥赤霉病病原菌的分離、驗證

為進一步驗證小麥赤霉病病原菌的LAMP檢測結果，選擇部分LAMP呈陽性樣本，采用組織分離法進行病菌分離[27]。將發病小麥穗剪成約0.5 cm × 0.5 cm的組織塊，在超凈工作上經70%酒精(v/v)表面消毒1 min，移至2%(v/v)NaClO中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次；用滅菌的濾紙片吸取殘存在組織塊表面的水分，并在超凈工作臺上吹干；將病組織置于PDA(potato dextrose agar)平板上，于黑暗條件下25 ℃培養3 d 后，挑取菌落邊緣菌絲轉入新的PDA培養基上純化病原菌。通過病原菌形態觀察，進行鐮孢菌屬的種類鑒定。參照許 娟[28]描述的CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide)法提取分離純化的菌絲體DNA，通過TEF-1a基因序列比對分析鑒定小麥赤霉病病菌的種類。

2 結果與分析

2.1 LAMP檢測結果

7個LAMP檢測體系對某被測樣本的檢測結果(圖1)顯示，可特異性識別亞細亞鐮孢(試管編號2號，下同)、禾谷鐮孢(3號)和擬輪枝鐮孢(8號)的LAMP檢測結果呈陽性。判定該樣本病組織中包含亞細亞鐮孢、禾谷鐮孢和擬輪枝鐮孢3種病原菌。其他4種病原菌的LAMP檢測結果(4、5、6和7號)呈陰性，表明該樣本中不存在這4種小麥赤霉病病菌。151份小麥赤霉病樣本檢測結果(圖2)表明，所有樣本中共檢測到6種小麥赤霉病病菌，亞細亞鐮孢的檢出率最高，達100%；其次為藤倉鐮孢，檢出該種病菌的樣本有15份，檢出率為10.0%；隨后依次為禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢和擬輪枝鐮孢，檢出樣本數分別為10、4、3和1，檢出率依次為6.0%、2.6%、2.0%和0.6%。所有樣本均未檢測到木賊鐮孢。

1:陽性對照;2～8:被測樣品分別對亞細亞鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、藤倉鐮孢、燕麥鐮孢、木賊鐮孢、擬輪枝鐮孢的檢測結果;9:陰性對照

1:Positive control;2-8:Sample tested result forFusariumasiaticum,F.graminearum,F.culmorum,F.fujikuroi,F.avenaceum,F.equisetiandF.verticillioides,respectively;9:Negative control

圖1小麥赤霉病菌的LAMP檢測結果

Fig.1DetectionofFusariumspeciescausingwheatscabusingLAMPassays

不同地點的病原菌種類分布有所差異(表3)。151份樣本中有122份樣本僅檢測到亞細亞鐮孢，表明被測樣本由亞細亞鐮孢單獨侵染引起。另有29份樣本檢測到2種或3種鐮孢菌，占被測總樣本數的19.2%，表明這些樣品所在地區小麥赤霉病存在復合侵染狀況，且均由亞細亞鐮孢與藤倉鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢或擬輪枝鐮孢復合侵染引起。由此可見，江蘇中部地區引起小麥赤霉病的優勢種為亞細亞鐮孢，藤倉鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢和擬輪枝鐮孢的也有零星分布。

F.asia:Fusariumasiaticum;Ff:F.fujikuroi;Fg:F.graminearum;Fc:F.culmorum;F.aven:F.avenaceum;Fv:F.verticillioides;Fe:F.equiseti. 下同. The same in table 3 and 4.

圖2引起小麥赤霉病的7種鐮孢菌的LAMP檢測結果

Fig.2LAMPdetectionofFusariumspeciescausingwheatscab

表3江蘇中部地區引起小麥赤霉病的鐮孢菌種類及分布

Table3FusariumspeciescausingwheatscabandtheirdistributioninthemiddleareaofJiangsu

病菌種數No．ofspecies鐮孢菌種類Fusariumspp．樣本數No．ofsamples采集地點Samplingsite一種OnespeciesF．asia122句容、江寧、浦口、儀征、廣陵Jurong，Jiangning，Pukou，Yizheng，Guangling兩種TwospeciesF．asia+Ff13句容、江寧 Jurong，JiangningF．asia+Fg6句容、江寧、浦口 Jurong，Jiangning，PukouF．asia+Fc4江寧、儀征 Jiangning，YizhengF．asia+F．aven2廣陵 Guangling三種ThreespeciesF．asia+Fg+Ff2句容、江寧 Jiangning，JurongF．asia+Fg+Fv1句容 JurongF．asia+Fg+F．aven1廣陵 Guangling合計Total151

檢測結果(表3)表明，亞細亞鐮孢在江蘇中部5個采集地區均有分布，而藤倉鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢和擬輪枝鐮孢5種小麥赤霉病病菌僅在局部地區被檢測到。例如，禾谷鐮孢在句容、江寧、浦口和廣陵有分布，而黃色鐮孢和燕麥鐮孢僅在揚州的廣陵區被檢測到。

2.2 陽性樣本的病原菌分離驗證

為了驗證LAMP檢測結果的準確性和可靠性，選擇34份LAMP陽性樣本，包含僅單獨檢測到亞細亞鐮孢以及同時檢測到2或3種鐮孢菌的樣本，對其進行病原菌分離與鑒定。結果(表4)表明，從僅檢測到亞細亞鐮孢的10份陽性樣本，以及檢測到亞細亞鐮孢與其他種類鐮孢菌復合侵染的24份陽性樣本中均分離出亞細亞鐮孢，進一步證實亞細亞鐮孢為江蘇中部地區引起小麥赤霉病的優勢種。在24份檢測到2種或3種鐮孢菌的陽性樣本中，除燕麥鐮孢外，其余4個種均被分離出來，該結果進一步證實藤倉鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢和擬輪枝鐮孢是該地區小麥赤霉病發生的病原菌種類。除亞細亞鐮孢外，LAMP檢測結果與分離結果存在一定差異，例如，從9份同時檢測到亞細亞鐮孢和禾谷鐮孢的陽性樣本中，僅4份分離出禾谷鐮孢(表4)(表4中將一份樣本中分離到的同1種病原菌記載為該病原菌的1個菌株)。

本研究未能從3份檢測到燕麥鐮孢的陽性樣本中分離出該病原菌，可能與該病菌生長速度較其他鐮孢菌慢，其菌落被其他病原菌覆蓋故未能獲得純培養所致。陽性樣本的病原菌分離驗證結果表明，本研究采用的LAMP檢測技術具有準確性和可靠性，可作為小麥赤霉病菌種群組成研究的新技術。

表4LAMP檢測陽性樣本的分離與鑒定

Table4IsolationandidentificationofFusariumspp.frompositivesamplesdetectedbyLAMPassay

ALMP檢測結果ResultdetectedbyLAMP樣本數No．ofsample分離到鐮孢菌種類Fusariumspp．isolated鐮孢菌Fusariumspp．數量NumberF．asia10F．asia10F．asia+Ff9F．asia9Ff1F．asia+Fg5F．asia5Fg2F．asia+Fc4F．asia4Fc1F．asia+F．aven2F．asia2F．aven0F．asia+Fg+Ff2F．asia2Fg1Ff0F．asia+Fg+Fv1F．asia1Fv1Fg0F．asia+Fg+F．aven1F．asia1Fg1F．aven0

3 討 論

小麥赤霉病病菌種類的檢測與鑒定是研究小麥赤霉病發生發展及其預防和抗病育種的基礎。由鐮孢菌引起的小麥赤霉病的檢測診斷主要依據病害癥狀和病原菌的形態學特征。近年來已報道的基于PCR的分子生物學鑒定技術也逐步應用于小麥赤霉病菌的檢測[17,18,28-30]。已有的檢測方法大多需要先分離獲得病原菌的純培養，然后提取病原菌DNA進行基因序列比對，整個檢測鑒定過程費時、費工，操作比較繁瑣，且效率低。張 林等[31]采用 Chelex-100法從病害標樣材料上直接提取DNA與特異性分子標記檢測相結合的方法快速檢測小麥赤霉病病菌，較之以往的PCR技術更為簡便、快速，但該方法對于發病癥狀不明顯病組織的檢測效果欠佳。本研究采用的LAMP技術特異性強，所設計的4條引物可識別6個靶標區段，其特異性較普通PCR有較大提升，靈敏度高，本研究應用的7個LAMP檢測體系的靈敏度均能達到pg(picogram，1 g=109 pg)級水平；對DNA模板質量要求低，可從病組織中提取的包含有寄主植物、病原菌和其他腐生微生物的DNA中直接檢出目標病原菌；檢測所需時間短，完成一次檢測(從病組織DNA提取至獲得LAMP檢測結果)僅需2 h左右；操作簡單，經濟實用，不需要昂貴的儀器設備。值得指出的是，本實驗室研發的7個LAMP檢測技術是分別特異性針對7種小麥赤霉病病菌的，因而病原菌的檢測與種的鑒定可同步完成。

本研究確定亞細亞鐮孢為江蘇省中部地區小麥赤霉病的優勢致病菌，與前人的研究結果基本一致[12,15,16,30,32]。本研究發現由該鐮孢菌引起的小麥赤霉病比重顯著上升。假禾谷鐮孢(F.pseudograminearum)是引起小麥莖基腐病的主要致病菌[33]，在河南省分布較廣泛，同時該鐮孢菌也是部分地區小麥赤霉病的致病菌[13,34]。本研究也應用本實驗室研發的假禾谷鐮孢的LAMP檢測技術對該病原菌進行了檢測，151份小麥赤霉病樣本的檢測結果均為陰性(結果未顯示)，表明該鐮孢菌對目前江蘇中部地區小麥赤霉病的發生可能不起作用。雖然本研究基本涵蓋了小麥赤霉病的主要致病菌種類，但是由于本實驗室研發的LAMP技術體系檢測的病原菌種類數量有限，還需進一步研發其他小麥赤霉病病菌的LAMP檢測體系，以補充完善小麥赤霉病病菌的快速檢測技術。

綜上所述，本研究應用LAMP技術明確了江蘇省中部地區小麥赤霉病菌的種群組成和地理分布，對小麥赤霉病的田間防治有一定的參考價值，并為小麥赤霉病菌的快速檢測和鑒定提供了新的方法。

致謝：南京農業大學王秀娥老師、揚州大學陳孝仁老師為本研究采集部分小麥赤霉病樣本，謹此致謝！

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