一株鉻還原菌的分離鑒定及鉻還原特性研究

楊宇 ，高宇，程潛，朱振宇，胡婷婷，徐全，李愛民

1.中南大學資源加工與生物工程學院，湖南 長沙 410083；2.中南大學教育部生物冶金重點實驗室，湖南 長沙 410083；3.湖南省煤炭科學研究院，湖南 長沙 410004

鉻是一種被廣泛使用的有毒重金屬，在電鍍、皮革鞣制、木材保護、紡織染色和金屬加工等工藝中都有大量應用（Zahoor et al.，2009）。鉻在自然條件下以 Cr(Ⅱ)到 Cr(Ⅵ)9種氧化態存在，但在大氣、土壤和水中最常見的鉻化合物是以 Cr(Ⅵ)或Cr(Ⅲ)形式存在（Thacker et al.，2006）。Cr(Ⅲ)是生物所必需的微量營養元素，相對難溶于水，無致癌性；而Cr(Ⅵ)主要以Cr2O72-和CrO42-形式存在，相比于Cr(Ⅲ)，其具有高遷移性、高水溶性和對所有生物體有毒等特性。Cr(Ⅵ)對人體產生毒害的主要表現形式是出現皮炎、肺和鼻中隔侵襲性反應（Shih et al.，2015）。

根據EPA與EU等規定，水體中的最大總鉻濃度限值為 0.1 mg·L-1，Cr(Ⅵ)濃度限值為 0.05 mg·L-1（Graham et al.，2010）。目前由于不合理的處理方式，造成了嚴重的環境鉻污染，在普通廢水殘渣中Cr(Ⅵ)含量超出背景值數千倍（Zhong et al.，2016）。在這種情況下，如果工業含鉻廢水廢物無法被有效解決，可能導致天然水源的污染，并最終威脅人類健康。

常規的Cr(Ⅵ) 修復方式包括化學還原（Chen et al.，2015；Graham et al.，2010）、離子交換（Alvarado et al.，2013；Hamdi et al.，2013）、吸附（Alothman et al.，2012；Wang et al.，2013；Jung et al.，2012）、電化學（Xafenias et al.，2015；Dharnaik et al.，2014）等方法，而這些方法成本昂貴，并會消耗大量的化學物質且易造成二次污染。為了克服這些常規方法的缺陷，學者們將關注點集中于利用微生物來吸附或還原Cr(Ⅵ)，相比于化學材料吸附和電化學修復等技術，微生物修復技術更為環保高效，且反應溫和，成本低廉，操作簡單，不易對環境造成危害（Khorramabadi et al.，2012），可為中國環保高效修復鉻污染開辟一條嶄新的途徑。因而，本研究從長沙鉻污染場地分離出一株對Cr(Ⅵ)還原及耐受能力較強的菌株G-12，并進一步探尋該菌種在不同培養條件下的鉻還原特性，以期實現該菌株在實踐修復鉻污染場地中的工程應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

供試土樣采集于湖南某鉻鹽廠，隨機取樣，經過自然風干，研磨，過200目篩所得。

1.1.2 培養基

用改良的LB培養基篩選、培養G12菌。培養基成分（He et al.，2014）為：蛋白胨 10 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，磷酸氫二鉀0.05 g·L-1，七水硫酸鎂0.2 g·L-1；若為固體 LB 培養基，則加瓊脂1.5%～2.0%，pH 8.5～9.0，121 ℃，20 min高溫高壓蒸汽滅菌。

1.1.3 鉻標準液

10 g·L-1Cr(Ⅵ)標準液（Viti et al.，2003）：稱取烘干的（120 ℃，2 h）重鉻酸鉀2.84 g溶于100 mL去離子水中，過濾除菌，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集分離純化

取土樣10 g加入到90 mL改良的滅菌液體LB培養基中，170 r·min-1、30 ℃振蕩60 min進行富集培養，之后以10倍梯度稀釋，各吸取0.2 mL涂布在含200 mg·L-1Cr(Ⅵ)的固體改良LB培養基上，在30 ℃恒溫培養箱中培養24 h（楊文玲等，2013），觀察記錄不同單菌落特征，之后挑取不同形態的單菌落進行劃線純化，即可得到具Cr(Ⅵ)抗性的純菌株。反復純培養之后將篩選出的Cr(Ⅵ)抗性菌株接種于含50 mg·L-1Cr(Ⅵ)的改良液體LB培養基中，隔一定時間后取樣，利用原子吸收分光光度計測定總鉻濃度，用紫外分光光度計測定Cr(Ⅵ)濃度，即可篩選出六價鉻還原菌株（Zhang et al.，2016）。

1.2.2 菌株鑒定

菌株的個體形態觀察以及菌株的生理生化特征參照郝宇（2015）進行操作分析。

16S rRNA的擴增測序和系統發育樹的構建：菌株G12的基因組DNA提取參照《TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒》，以菌株G12的基因組 DNA 為模板，利用正向引物 27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTGGCTCAG-3’和反向引物 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’進行PCR擴增。PCR產物由上海鉑尚測序有限公司完成16S rRNA的測序。測序所得序列利用NCBI數據庫進行比對。根據 G-12及其相近種屬的 16S rRNA基因序列，采用Mega 7.0軟件構建系統發育樹，進行系統發育分析。

1.2.3 菌株G12最適溫度及pH測定

為了研究不同溫度對菌株G12生長的影響，將對數期菌株G12種子液以5%的接種量接種于相同規格的改良液體LB培養基中[含50 mg·L-1Cr(Ⅵ)]，分別置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃溫度下（Zhao et al.，2010）進行振蕩培養，空白對照為接種5%的無菌水LB培養基，隔不同時間取樣，檢測培養液在600 nm處的吸光值OD600，每個實驗重復3次；另外，分別配制一組相同規格的液體LB培養基，其中pH值分別設置為3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和 11.0（Poornima et al.，2010），再以5%的接種量接種到已滅菌的上述改良液體LB培養基中，置于30 ℃、170 r·min-1恒溫搖床中振蕩培養，隔不同時間觀測培養液的OD600值，每個實驗重復3次。

1.2.4 菌株G12對不同濃度的Cr(Ⅵ)的耐受性及還原性研究

將對數期菌株G12的種子液以5%的接種量分別接種到含 50、100、200、400 和 600 mg·L-1Cr(Ⅵ)已滅菌的改良液體LB培養基中進行恒溫振蕩培養（Dhal et al.，2013），隔不同時間取樣檢測培養液的OD600值來觀測菌株的生長狀況，同時采用DPCI比色法（陳育翔，2008）測定 OD540處 Cr(Ⅵ)的濃度，進而檢測菌株對Cr(Ⅵ)的還原效果，每個實驗重復3次。

1.2.5 以不同碳源為電子供體對菌株 G12生長及Cr(Ⅵ)還原性的影響

將對數期菌株G12的種子液以5 %的接種量分別接種到含一定濃度葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉、甘油已滅菌的改良液LB培養基中[含50 mg·L-1Cr(Ⅵ)]進行恒溫振蕩培養（Lin et al.，2011），利用OD600值來檢測菌株的生長狀況，同時利用比色法測定菌株對Cr(Ⅵ)的還原效果，每個實驗重復3次。

1.2.6 不同鹽濃度對菌株G12生長及Cr(Ⅵ)還原性的影響

將對數期菌株G12以5%的接種量分別接種到含 5、10、15、20 和 25 g·L-1NaCl濃度的改良液體LB 培養基中[含 50 mg·L-1Cr(Ⅵ)]進行恒溫振蕩培養（Terahara et al.，2015），隔不同時間取樣檢測培養液的OD600值來觀測菌株的生長狀況，同時利用 DPCI比色法測定 OD540值檢測菌株對 Cr(Ⅵ)的還原效果，每個實驗重復3次。

1.2.7 不同重金屬離子對菌株G12生長及Cr(Ⅵ)還原性的影響

將對數期菌株G12以5%的接種量分別接種到含 50 mg·L-1Ni2+、50 mg·L-1Zn2+、50 mg·L-1Cd2+、50 mg·L-1Mn2+、50 mg·L-1Cu2+的改良 LB 培養基中[含 50 mg·L Cr(Ⅵ)]進行恒溫振蕩培養（Narayani et al.，2013），隔不同時間取樣檢測培養液的 OD600值來觀測菌株的生長狀況，同時利用DPCI比色法測定OD540值檢測菌株對Cr(Ⅵ)的還原效果，每個實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 菌株G12鑒定

2.1.1 菌株G12的形態特征及生理生化特征

在光學顯微鏡下，菌株 G12呈圓桿狀，可游動，但游動緩慢，革蘭氏染色呈陽性；G12在固體改良LB培養基上培養24 h后，菌落呈乳白色嚙齒狀，邊緣不規則，不透明，粗糙，中心褶皺、干巴，不易挑取，專性好氧，菌株的具體菌落形態如圖1所示。

菌株G12所對應的生理生化反應結果如表1所示。吲哚試驗、V-P試驗、甲基紅試驗均呈現陽性，且可利用單糖、二糖，但不能利用多糖類物質。

圖1 菌株G12的菌落形態圖Fig.1 Colony morphology of strain G12

2.1.2 16S rRNA基因測序和系統發育分析

以菌株G12的DNA為模板，以27F、1492R為引物進行 PCR擴增，并測定了其序列。經 16S rRNA基因測序及同源性比較，結合生理生化鑒定，結果顯示該菌株 G12的 16S rRNA基因序列與Bacillus pumilusATCC 7061（NR 043242.1）序列的相似性可達到99%，確定分離的菌株G12為短小芽孢桿菌（B.pumilus），暫命名為B.pumilusG12。將該菌株與同源性高的細菌進行系統發育分析，得到系統進化發育樹（圖2）。

2.2 溫度及pH對菌株G12生長的影響

將菌株G12置于改良后的LB液體培養基中培養，在25～45 ℃的溫度范圍內都可以較好地生長，其中在 25 ℃和 30 ℃的培養條件下，菌株生長得最好（圖3A）；在高于40 ℃的培養條件下，菌株生長狀況較差，說明該菌株適宜于在中溫環境下生長。菌株G12在pH值為5.0～10.0的改良LB液體培養基中均可生長，最適生長pH為9.0（圖3B），而在pH 3.0和pH 11.0這種極酸和極堿的培養條件下，菌株G12的生長受到抑制，幾乎不能生長。說明菌株G12適宜在中性及偏堿性的環境中生長。

2.3 菌株G12對不同濃度Cr(Ⅵ)的耐受性及還原性研究

在細菌生長過程中，Cr(Ⅵ)濃度會影響細菌生長及其對Cr(Ⅵ)的去除效率。隨著Cr(Ⅵ)濃度的升高，菌體對 Cr(Ⅵ)的還原時間延長，Cr(Ⅵ)的還原效率降低（Gutiérrez et al.，2010）。由圖4A可知，菌株G12在50 mg·L-1Cr(Ⅵ)濃度下生長趨勢最好，在 50～200 mg·L-1Cr(Ⅵ)培養液中，菌株的生長幾乎沒有受到抑制，均可快速生長。當 Cr(Ⅵ)濃度達到400 mg·L-1時，菌株的生長出現延滯期，另外，培養液中Cr(Ⅵ)濃度達到600 mg·L-1時，菌株的生長受到嚴重抑制，不能生長。說明隨著培養液中 Cr(Ⅵ)濃度倍增，菌株的耐受性也逐級遞減，可能是隨著Cr(Ⅵ)濃度的升高，Cr對菌體的致毒性增強，因而出現抑制菌體生長的現象，而400 mg·L-1Cr(Ⅵ)溶液對菌體生長是一個閾值。同時，菌株G12在不同濃度 Cr(Ⅵ)下的還原趨勢如圖 4B所示，隨著初始Cr(Ⅵ)濃度的升高而下降，在50、100、200、400和600 mg·L-1的初始 Cr(Ⅵ)濃度條件下，菌株在 96 h時的鉻還原率分別為66.2%，35.7%，26.1%，16.0%和6.0%。這可能是初始Cr(Ⅵ)濃度的升高，使得菌體G12的生長受到抑制，進而抑制了G12體內鉻還原酶的能力，表現出還原率遞減趨勢。

表1 G12菌株的生理生化特征Table1 Physiological and biochemical characteristics of G-12 strain

圖2 基于16S rRNA序列同源性構建菌株G12的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain G12

圖3 不同溫度及pH條件下菌株G12的生長曲線Fig.3 Growth curves of strain G12 at different temperatures and pH

圖4 不同初始Cr(Ⅵ)濃度下菌株G12的生長曲線及還原特性Fig.4 Growth curve and reduction characteristics of strain G12 at different initial concentrations of Cr ()Ⅵ

2.4 以不同碳源為電子供體對菌株 G12生長及Cr(Ⅵ)還原性的影響

圖5 不同電子供體條件下菌株G12的生長曲線及還原特性Fig.5 Growth curve and reduction characteristics of strain G12 under different electron donor conditions

碳源的類型包括糖類、有機酸、脂類、醇類這4種類型，而這4類碳源可在氧化還原過程中作為電子供體參與微生物生長過程中體內電子的傳遞，且不同電子供體對菌株的作用也存在較大差異（Ge et al.，2015）。由于微生物可優先利用更有利于生長的電子供體，因而選擇合適的電子供體對提高Cr(Ⅵ)的還原能力極其重要。本實驗選取乳酸鈉、蔗糖、甘油、葡萄糖4種不同碳源，研究其對菌株G12的生長及還原特性（圖5）。如圖5A所示，菌株G12在12 h內在4種類型的碳源條件下均以指數形式增長，但隨著時間延長，菌體在不同碳源類型的培養液中的生長均受到影響，具體生長速度表現為：乳酸鈉＞甘油＞葡萄糖＞蔗糖。說明菌株可較好地利用脂類及有機酸類碳源，而對糖類的利用效果不佳。圖5B所示為菌株G12在以不同碳源作外加電子供體時對Cr(Ⅵ)的還原趨勢圖。由圖可知，以 4種類型的碳源作外加電子供體條件下，菌株G12對Cr(Ⅵ)的還原能力表現為：甘油＞乳酸鈉＞葡萄糖＞蔗糖。在以甘油為電子供體時，菌株G12對Cr(Ⅵ)的還原受到顯著促進，在 60 h內，菌株對Cr(Ⅵ)的還原效果明顯，可將培養液中 50 mg·L-1Cr(Ⅵ)還原至0，還原率達100%；乳酸鈉對Cr(Ⅵ)的還原雖有促進作用，但效果略低于甘油，而在以葡萄糖和蔗糖為電子供體時，菌株對Cr(Ⅵ)的還原效果較差，這說明菌株在以脂類及有機酸類碳源為電子供體時，可顯著促進菌株G12對Cr(Ⅵ)的還原，而以糖類為電子供體時，菌株生長受到抑制，進而抑制了菌株對Cr(Ⅵ)的還原能力。

2.5 不同鹽濃度對菌株G12生長及Cr(Ⅵ)還原性的影響

圖6 不同NaCl鹽濃度條件下菌株G12的生長曲線及還原特性Fig.6 Growth curve and reduction characteristics of strain G12 under different NaCl concentrations

NaCl濃度反映了菌株對環境滲透壓的耐受，且NaCl濃度可影響細菌生存（Terahara et al.，2015）。在穩定滲透壓溶液中細菌細胞內含水量穩定，細菌生長最好（Ciacci et al.，2012）。在鹽濃度過低或過高的情況下，菌體會因失水或水分過多脹破而導致菌量下降。在實踐中偶爾會出現高鹽鉻污染廢水，因此本實驗考察了菌株G12對NaCl濃度的耐受性及其對Cr(Ⅵ)的還原特性。圖6A所示為不同NaCl濃度條件下菌株G12的生長曲線。由圖可知，隨著NaCl濃度的增加，菌株G-12的生長相應受到抑制，但菌株G12也可耐受高鹽環境。圖6B所示為菌株G12在不同NaCl濃度下對50 mg·L-1Cr(Ⅵ)的還原趨勢圖。由圖可知，在10 g·L-1NaCl濃度下，菌株的生長狀況較好，相對應的Cr(Ⅵ)去除能力較強，在48 h時，菌株可還原50%的Cr(Ⅵ)，在96 h時菌株還原率達到85%；在15 g·L-1和20 g·L-1NaCl濃度下，菌株的還原能力較強，可將 50 mg·L-1Cr(Ⅵ)還原至20 mg·L-1，還原率可達60%；而在25 g·L-1NaCl濃度下，相對5 g·L-1而言，菌株對Cr()Ⅵ的還原率受到明顯抑制，還原率僅為40%。說明高鹽濃度會抑制菌株對 Cr(Ⅵ)的還原能力，在 10～20 g·L-1NaCl濃度下，菌株還原能力較強，故菌株G12可應用于鹽濃度偏高的鉻污染廢水處理。

2.6 不同重金屬離子對菌株G12生長及Cr(Ⅵ)還原性的影響

在自然環境及工業污染場地，通常存在多種金屬離子，不同金屬離子會對微生物的生理生化特性產生不同的影響（Narayani et al.，2013）。在多種金屬離子共存的條件下，不同的金屬離子可能對細菌Cr(Ⅵ)還原產生一定的促進或抑制作用（Alam et al.，2011）。因此，本實驗考察了菌株與Cd2+、Ni2+等5種重金屬離子的協同與拮抗作用。由圖7A可知，在培養液中加入其他重金屬離子對菌株G12生長均具有一定的抑制作用，尤其是Cd2+，幾乎完全抑制了菌株生長；其次是Zn2+，對菌株生長的抑制作用也較強；培養液中Ni2+、Cu2+、Mn2+雖對菌株生長有抑制作用，但抑制作用不顯著，可使菌株正常生長。圖7B所示為菌株G12在含50 mg·L-1不同重金屬離子濃度下對Cr(Ⅵ)的還原趨勢圖。由圖可知，含不同重金屬離子的培養液均對菌株G12還原Cr(Ⅵ)具有一定抑制作用，尤其是當培養液中存在時，菌株G12對Cr(Ⅵ)還原率最低，說明一定濃度的Cd2+對菌株還原Cr(Ⅵ)的抑制強烈。而培養液在含有 Mn2+時，對細菌還原 Cr(Ⅵ)的抑制作用小，幾乎不影響其對Cr(Ⅵ)的還原。具體抑制作用表現為 Cd2+＞Ni2+＞Zn2+＞Cu2+＞Mn2+。這說明環境中存在的混合重金屬會對菌株G12細胞產生毒性，進而抑制其對Cr(Ⅵ)的還原能力。

3 結論

（1）本研究從湖南省某鉻鹽廠篩選出一株對Cr(Ⅵ)具有還原能力的適宜于偏堿性、中溫環境中生長的異養菌G12。經過對菌株與菌落的形態學特征觀察、生理生化實驗和16S rRNA序列分析，鑒定該菌株G12為短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus），暫命名為BacilluspumilusG12。

（2）短小芽孢桿菌G12的生長條件試驗結果表明，該菌株具有較寬泛的 pH生長范圍，在 pH 7.0～9.0范圍內，尤其是pH=9.0條件下生長良好，但不能耐受極酸極堿的環境；短小芽孢桿菌G12生長的最佳溫度是30 ℃，并可略耐受中高溫。

（3）測試不同初始鉻濃度、碳源、鹽濃度、金屬離子條件對G12菌株對Cr(Ⅵ)還原能力的影響，發現該菌株具備較好的Cr(Ⅵ)耐受及還原能力，在低濃度時，菌株Cr(Ⅵ)還原能力較強，隨著鉻濃度倍增，還原能力遞減；在以乳酸鈉、蔗糖、甘油、葡萄糖 4種不同碳源為外加電子供體時，菌株對Cr(Ⅵ)的還原率表現為：甘油＞乳酸鈉＞葡萄糖＞蔗糖；菌株G12可耐受較高鹽濃度，在10 g·L-1NaCl濃度下，其相對應的Cr(Ⅵ)去除能力較強，在48 h時，菌株可還原50%的Cr(Ⅵ)；含50 mg·L-1不同重金屬離子培養液對菌株G12還原Cr(Ⅵ)的能力均具有一定抑制作用，具體抑制作用表現為：菌株在高毒性的重金屬環境中仍存在一定還原能力，說明菌株G12在鉻污染修復中具有良好的應用潛力。

圖7 不同重金屬離子條件下菌株G12的生長曲線及還原特性Fig.7 Growth curve and reduction characteristics of strain G12 under different heavy metal ions

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