谷氨酰胺轉氨酶改善內酯豆腐凝膠強度的作用機理

楊海鵬，華欲飛，陳業明，張彩猛，孔祥珍

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214222)

谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase，簡稱TGase或TG酶)是一種催化蛋白質分子間或分子內形成ε-(γ- 谷氨酰基)賴氨酸共價鍵的酶,可以催化蛋白質分子之間發生交聯，將蛋白質分子黏合起來，改善蛋白質的凝膠性、乳化性等功能特性[1-2]。目前廣泛應用于牛、豬、雞肉等肉制品及豆制品的黏合，改善其口感、風味、組織結構和營養，提高產品附加值[3-6]。

內酯豆腐是優質的植物蛋白食品，是大豆蛋白在GDL作用下相互結合形成的三維網狀結構的凝膠產品。其形成機理是GDL在室溫下水解為葡萄糖酸，使豆漿pH值降低至大豆蛋白的等電點從而使豆漿凝固，形成內酯豆腐[7-8]。雖然其口感光滑細膩、營養價值高、充填包裝便于攜帶等優點，但是市售內酯豆腐普遍較軟，常用于涼拌，不易烹飪進一步加工食用[9-10]。本實驗通過研究不同TG酶作用條件對內酯豆腐凝膠強度的改善作用及TG酶的作用機理，為實際生產中TG酶的應用及內酯豆腐品質的改善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，普通大豆為市售東北大豆，成分缺失大豆由東北農業大學提供；葡萄糖酸-δ-內酯，江西新黃海醫藥食品化工有限公司；谷氨酰胺轉氨酶，上海東圣食品有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍R250，Sigma-Aldrich公司；標準分子量蛋白，伯樂生命醫藥產品(上海)有限公司；甘油、溴酚藍、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器和設備

BLST4090B-073豆漿機，匯勛電器制品有限公司；垂直電泳儀、凝膠成像儀，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；TA-XT2質構儀，美國TA儀器公司。

1.3 工藝流程及操作要點

大豆→浸泡→磨漿→煮漿及冷卻→加內酯及TG酶→保溫處理→滅酶及冷卻→酶促內酯豆腐

浸泡：用去離子水清洗，25 ℃下以體積分數0.5%的NaHCO3溶液浸泡12 h。

磨漿：干豆水比1∶7(g∶mL)磨漿后稀釋得到固形物含量為8%、pH6.86、蛋白質含量3.60%的生漿。

煮漿及冷卻：水浴加熱豆漿中心溫度95 ℃下保溫5 min，迅速冷卻到30 ℃以下。

加內酯及TG酶：市售葡萄糖酸內酯為顆粒狀，易溶于水；TG酶為粉末狀，加入水中易聚集；故以溶液方式加入，先內酯，再加入TG酶，并充分攪拌。

滅酶及冷卻：TG酶在70 ℃仍有一定活性，選擇95 ℃水浴保溫10 min方式滅酶；4 ℃保存以備凝膠強度測量及其他分析。

此外還有基質金屬蛋白酶、血管內皮生長因子C、抗胞質角蛋白、PTEN基因等作為宮頸癌微轉移檢測的標志物，但文獻報道較少，而這些標志物均需要大樣本的研究及探索去證實其有效性。

1.4 實驗方法

1.4.1 TG酶作用條件對內酯豆腐凝膠強度的影響

以內酯豆腐凝膠強度為指標進行研究。分別研究GDL添加量(0.10%TG酶量，GDL添加量為0、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%；50 ℃+1 h保溫處理)(添加量均以質量分數表示)、TG酶添加量(0.30%GDL量，TG酶量為0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%；50 ℃+2 h保溫處理)、保溫溫度(0.30%GDL量，0.10%TG酶量，不同保溫溫度：40、45、50、55、60 ℃，保溫2 h)、保溫時間(0.30%GDL量，0.10%TG酶量，不同保溫時間：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，保溫溫度50 ℃)對內酯豆腐凝膠強度的影響。

1.4.2 內酯豆腐凝膠強度的測定

采用質構儀中P25探頭選擇穿刺模式，所有樣品均為50 mL豆漿初樣放置100 mL燒杯中測量，平行測定3次[11]。測試條件：壓縮距離10 mm，測前速度3 mm/s，測中1 mm/s，測后3 mm/s。

1.4.3 SDS-PAGE凝膠電泳樣品的制備和分析

豆腐的凝膠電泳方法參照LAEMMLI[12]和閆尊浩[13]的方法。TG酶作用下的內酯豆腐凝膠強度提高，更不易溶于水，取少許豆腐研碎后，用6%的SDS溶液(體積分數)稀釋10倍，并攪拌至完全溶解。蛋白電泳中單一條帶的相對含量均以第1泳道對應條帶含量為參考量1，進行相對含量分析。

1.4.4 統計分析

內酯豆腐的凝膠強度平行測定3次，結果以平均值表示。采用Origin8軟件作圖，SPSS 17.0數據統計分析軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 TG酶作用條件對內酯豆腐凝膠強度的影響

由圖1-a及實驗現象可知，當GDL添加量小于0.20%時，體系pH較高，豆漿不凝固、不成形；當GDL添加量為0.25%～0.35%，體系pH繼續下降，接近大豆蛋白的等電點，酶促內酯豆腐的凝固狀況改善，凝膠強度也隨之增大；GDL添加量大于0.35%，體系pH值繼續下降，酶促內酯豆腐中開始析出黃漿水，且黃漿水的質量增加，凝膠強度下降，結構變得粗糙出現孔洞，直至變成松散的漿體。GDL添加量為0.30%時，酶促內酯豆腐凝膠狀況最佳，且凝膠強度最大，故GDL的最佳添加量為0.30%。

圖1 GDL量(a)、TG酶量(b)、保溫溫度(c)、保溫時間(d)對酶促內酯豆腐凝膠強度的影響
Fig.1 Effect of GDL concerntration(a)，TGase concerntration(b)，reaction temperature(c)，reaction time(d) on rupture strength of lactone Tofu

圖1-b顯示,加入TG酶可顯著增強豆腐的凝膠強度，當酶添加量為0.05%時，凝膠強度達到最大；繼續增加TG酶量，內酯凝膠強度逐漸下降。因此，最佳TG酶添加量為0.05%。SAKAMOTO等[14-15]研究發現,隨著TG酶量增大,蛋白質分子表面的作用位點可能很快被交聯而降低了其與周圍其他蛋白分子進行交聯的幾率，因而形成的分子間交聯要比加酶量小的情況要少，而對凝膠強度起改善作用的，應該是蛋白質分子間交聯形成空間網絡結構。因此，當TG酶量為0.05%時，交聯后的蛋白聚集體相對較小，在體系分布中均勻，進一步增大TG酶量，蛋白聚集體進一步交聯，形成更大的交聯，導致蛋白質在整個體系中分布不均勻，不平衡的結構就容易被破壞，凝膠強度變小。

圖1-c顯示隨反應溫度的增加，酶促內酯豆腐的凝膠強度逐漸增加，當溫度達到50～55 ℃之間時，凝膠強度達到最大；隨著反應溫度的繼續增加，凝膠強度會顯著下降。不同保溫溫度，TG酶作用下內酯豆腐的凝膠強度、TG酶的酶活性及TG酶作用下內酯豆腐蛋白組分變化情況具有一定的相關性。相關實驗證明，不同溫度下，TG酶作用下內酯豆腐凝膠強度的變化與TG酶的酶活變化具有一致性。因此，TG酶作用較合適的溫度為50～55 ℃之間。

圖1-d顯示隨保溫時間的延長，酶更能與蛋白充分作用，使凝膠強度逐漸增加，但考慮生產、成本因素，作用時間應控制在合量的范圍內，故本實驗選3 h為最長保溫時間。

2.2 TG酶作用條件對蛋白組分的影響

2.2.1 TG酶添加量對內酯豆腐蛋白組分的影響

由圖2分析可知，當TG酶添加量由0增加到0.05%時，α’、α亞基亦大幅度下降至條帶消失，A3肽鏈直接消失，β、γ亞基和A肽鏈均有明顯下降；隨著TG酶量繼續增加，β亞基、γ亞基、A肽鏈、聚合體和B肽鏈的相對含量均繼續緩慢下降，但B肽鏈變化程度最小。由此推測，7S中的α’、α亞基及11S中的A3肽鏈與TG酶的作用關系最密切，其次是7S中β、γ亞基及11S中的A肽鏈，最后可能有關聯的是11S中的B肽鏈。

圖2 不同TG酶添加量下酶促內酯豆腐蛋白還原電泳圖及蛋白組分相對含量變化
Fig.2 Effect of TGase concerntration on reducing SDS-PAGE and protein composition of lactone Tofu

2.2.2 保溫溫度對內酯豆腐蛋白組分的影響

由圖3分析可知，電泳條帶中7S主要成分α’、α、β、γ亞基，以及11S中的A肽鏈的相對含量的變化與前兩者呈負相關關系，A3肽鏈只有在70℃酶活比較低的時候存在；且不同溫度下，11S中B肽鏈的相對含量變化不明顯。不同溫度直接影響TG酶作用的活性，進而影響7S和11S分子間的交聯，同時影響酶促內酯豆腐的凝膠強度。因此，可得到同2.3.2一致的結論：7S中的α’、α亞基及11S中的A3肽鏈與TG酶的作用關系最密切，其次是7S中β、γ亞基及11S中的A肽鏈，最后可能有關聯的是11S中的B肽鏈。

圖3 不同保溫溫度下酶促內酯豆腐蛋白還原電泳圖及蛋白組分相對含量變化
Fig.3 Effect of reaction temperature on reducing SDS-PAGE and protein composition of lactone tofu

2.2.3 保溫時間對內酯豆腐蛋白組分的影響

如圖4所示，隨著TG酶作用時間的延長，濃縮膠上端含量逐漸增加，與TG酶作用下分子間交聯形成更大分子量成分有關； 7S中α’和α亞基大幅度下降，β和γ亞基也明顯下降；11S中A3肽鏈在1 h時直接消失，A肽鏈也明顯下降，但B肽鏈先維持不變后有少量下降。TG酶作用時間從0.5～1 h時，凝膠強度增度最大，同時電泳中α’、α亞基及A3肽鏈明顯下降或消失不見，由此推測這3種成分與TG酶作用關系最為顯著，其次為β、γ亞基和A肽鏈，最后可能有關系的是B肽鏈[16]。

圖4 不同保溫時間酶促內酯豆腐蛋白還原電泳圖及蛋白組分相對含量變化
Fig.4 Effect of reaction time on reducing SDS3PAGE and protein composition of lactone tofu

2.3 大豆品種對內酯豆腐凝膠強度及蛋白組分的影響

不同品種大豆之間，蛋白質組成及含量,影響豆腐的品質特性[17-18]。圖5顯示，對于低溫內酯豆腐(未加TG酶)，凝膠強度除7S-大豆稍低，其他3者相差不大，即LOX缺失對內酯豆腐凝膠強度影響不明顯，但7S缺失降低了其凝膠強度；對于酶促內酯豆腐，豆王牌>恒豐牌>LOX-大豆>7S-大豆。因此，7S缺失不利于TG酶對內酯豆腐凝膠強度的提高。

圖5 不同大豆品種對酶促內酯豆腐凝膠強度的影響
Fig.5 Effect of soybean varieties on rupture strength of lactone Tofu

由圖6可以清晰看到,TG酶作用下，7S中α’、α、γ亞基及11S中的A3肽鏈直接消失，7S中β亞基及11S中A肽鏈亦明顯減少，但11S中B肽鏈變化較之前不明顯，與之前結論一致。還原電泳圖證實酶促內酯豆腐溶解樣中剩余大量未被交聯的含有B亞基的組分；非還原條帶可以看出酶促內酯豆腐溶解樣中并沒有游離的B亞基，其中一小部分B以B2的形式存在，另外推斷有一部分含有B的成分是以AB的形式形成交聯的聚集體，但是B沒有直接參與交聯，當對這部分聚集體進行還原后，也可以得到B亞基和交聯的A，與相關文獻結論一致[19-20]。因此，不同大豆品種對內酯豆腐凝膠強度及蛋白組分的SDS-PAGE分析驗證了TG酶作用機理的結論。

A-非還原電泳;B-還原電泳
圖6 不同品種大豆酶促內酯豆腐蛋白電泳圖及蛋白組分相對含量變化
Fig.6 Effect of soybean varieties on SDS-PAGE and protein composition of lactone Tofu

3 結論

TG酶量對內酯豆腐凝膠強度影響較大。最佳工藝為：GDL用量0.3%，TG酶用量0.05%，50 ℃保溫3 h。此時，內酯豆腐的凝膠強度為570.5 g。

7S中的α’、α亞基及11S中的A3肽鏈與TG酶的作用關系最密切，其次是7S中β、γ亞基及11S中的A肽鏈，最后可能有關聯的是11S中的B肽鏈。氨基酸含量分析，得到α’、α、β亞基及A、B肽鏈中賴氨酸摩爾百分比分別是8.19%、9.52%、6.33%、8.07%和3.65%，即大豆蛋白中亞基或肽鏈中的賴氨酸含量與TG酶作用關系密切，賴氨酸含量越高關系越密切。實驗現象表明，適量TG酶可明顯改善內酯豆腐的凝膠強度，本研究為實際生產中TG酶用于改善內酯豆腐品質提供參考。