液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定魚肉中甲基汞不確定度分析

王艷春 籍術(shù)良 楊文英

水產(chǎn)動(dòng)物及其制品中甲基汞是重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，一個(gè)完整的測(cè)量結(jié)果，除了應(yīng)給出被測(cè)量的最佳估計(jì)值之外，還應(yīng)同時(shí)給出測(cè)量結(jié)果的不確定度。本研究依據(jù)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局(JJF1059.1-2012)“測(cè)量不確定度評(píng)定與表示”[1]標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定魚肉中甲基汞進(jìn)行不確定度分析，在實(shí)際工作中有較高的實(shí)用價(jià)值[2-3]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SA-10原子熒光形態(tài)分析儀(北京吉天儀器公司)；C18柱(天津博納艾潔爾)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；振蕩器(德國(guó)IKA)。

汞標(biāo)準(zhǔn)溶液：甲基汞溶液(63.6±2.4)μg/g；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：魚肉(GBW10029)來源于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。甲醇、乙酸銨(色譜純)、氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)、硼氫化鉀(KBH)、鹽酸(HCL)、氨水、L-半胱氨酸(優(yōu)級(jí)純)以及過硫酸鉀(分析純)來源于北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 測(cè)量方法

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[4](GB5009.17-2014)“食品中總汞及有機(jī)汞測(cè)定第三法”，稱取樣品1.00 g，置于15 ml離心管中，加入5 mol 10 ml的HCl提取試劑，放置過夜。于室溫下超聲水浴中提取60 min，中間振搖數(shù)次。于4 ℃下以離心8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。取2 ml上清液，緩慢加入1.5 ml的6 mol/L的NaOH，使樣液pH值為2～8，加入0.2 ml的10 g/L半胱氨酸溶液定容至5 ml，于4 ℃下以離心8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液過0.45 μm有機(jī)系濾膜，同時(shí)做空白對(duì)照。樣品濾液與標(biāo)準(zhǔn)曲線在相同的儀器條件下進(jìn)行分析。

1.3 測(cè)量數(shù)學(xué)模式建立

樣品經(jīng)提取處理后，用液相色譜-原子熒光光譜法進(jìn)行檢測(cè)，在一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度與甲基汞含量成正比，與甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度比較定量。測(cè)量不確定度數(shù)據(jù)模型計(jì)算為公式1：

式中X為樣品中甲基汞含量(μg/kg)；C為測(cè)定樣液中汞濃度值(μg/L)；a為截距；b為斜率；V為定容體積(ml)；G為樣品質(zhì)量(g)。

1.4 測(cè)量不確定度的來源分析

液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定魚肉中甲基汞不確定度的來源主要有：①樣品的稱重、提取和定容過程；②標(biāo)準(zhǔn)溶液的純度和稀釋過程；③液相色譜-原子熒光標(biāo)準(zhǔn)方法；④結(jié)果的重復(fù)測(cè)定[5-6]。

2 結(jié)果

2.1 不確定度分量的評(píng)定

2.1.1 稱量過程引入的不確定度u(m)

所用樣品可認(rèn)為樣品是均勻的，代表性充分，由此所致的不確定度可忽略不計(jì)。根據(jù)檢定證書可知所用天平的靈敏度為0.001 g，最大允許誤差為±0.5e(e=10 mg)，最大允差包括了天平校準(zhǔn)、稱量變動(dòng)性引起的最大允許誤差(天平顯示的數(shù)值是自動(dòng)顯示)，即最大允許誤差(a)=0.005 g。按均勻分布k=3，其計(jì)算為公式2：

由于天平稱量了兩次(空杯和空杯+樣品)，故天平引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為公式3：

式中u空(m)為空杯的不確定度；u樣(m)為空杯和樣品的不確定度。

由天平引起的相對(duì)不確定度計(jì)算為公式4：

式中urel(m)為天平引起的相對(duì)不確定度。

2.1.2 樣品提取過程回收率引入的不確定度u(Rec)

由于樣品提取不完全或提取過程中導(dǎo)致甲基汞的損失等，將使魚肉中甲基汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)不能100%進(jìn)入到測(cè)定液中，本法甲基汞的提取回收率為90%～110%，樣品回收率的不確定度計(jì)算為公式5：

式中b+為正回收率差值；b-為負(fù)回收率差值；b為回收率差值。

2.1.3 樣品定容體積影響引入的不確定度U(V)

在樣品提取過程中使用了10 ml和2 ml移液管及5 ml單標(biāo)容量瓶，分別計(jì)算不確定度分量。

(1)10 ml移液管不確定度u1(V10)。10 ml單標(biāo)線移液管證書給出示值允差±0.02 ml，按均勻分布屬B類，取k=3，則計(jì)算為公式6：

10 ml單標(biāo)線移液管充滿液體至刻度的估讀重復(fù)性±0.01 ml，按均勻分布屬B類，取k=3，則計(jì)算為公式7：

由單標(biāo)線移液管校準(zhǔn)溫度與使用溫度差別引起的不確定度u1.3(V10)：20 ℃時(shí)水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，玻璃的膨脹系數(shù)為1.5×10-5/℃。在實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)水溫Tt=25 ℃，在95%置信概率下的正態(tài)分布取k=2，則計(jì)算為公式8、公式9：

(2)2 ml移液管不確定度u2(V2)。2 ml單標(biāo)線移液管示值允差±0.008 ml，按均勻分布屬B類，取k=3，估讀重復(fù)性±0.005 ml。計(jì)算方法與上相似，得u2(V2)=0.27%。

(3)5 ml單標(biāo)線容量瓶不確定度u3(V5)。5 ml單標(biāo)線容量瓶示值允差±0.02 ml，按均勻分布屬B類，取k=3，估讀重復(fù)性±0.01 ml。計(jì)算方法與上相似，得u3(V5)=0.18%，則定容體積的影響計(jì)算為公式10：

樣品制備過程引入的不確定度計(jì)算為公式11：

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列配置引起的不確定度u(CS)

準(zhǔn)確稱取(63.6±2.4)μg/g甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液0.315 g于200 ml容量瓶中配制成甲基汞濃度為100.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)使用液，再用1000 μl移液槍分別吸取甲基汞濃度為100.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00 μl、25 μl、50 μl、100 μl、200 μl以及250 μl于10 ml容量瓶中，用流動(dòng)相配成0.00 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L，10.0 μg/L、20.0 μg/L以及50.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列。

(1)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度u(C0)。本測(cè)量所用甲基汞標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提供，證書給定(63.6±2.4)μg/g。按均勻分布處理k=3，則計(jì)算為公式12：

(2)稱量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引起的不確定度u(G0)。計(jì)算過程同2.1.1(稱量過程引入的不確定度)計(jì)算得u(m)=0.00408 g，由天平引起的相對(duì)不確定度計(jì)算為公式13：

(3)移液槍、容量瓶示值允差引起的不確定度u(V0)。①由移液槍引起的不確定度u1(V0)，1 000 μl移液槍示值允差±0.2%，移液槍重復(fù)性±1 μl，按均勻分布屬B類，取k=3；20 ℃時(shí)硬橡膠的膨脹系數(shù)為1.23×10-5/℃。在實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)水溫Tt=25 ℃，在95%置信概率下的正態(tài)分布取k=2，在標(biāo)準(zhǔn)液配置過程移液槍使用了5次，計(jì)算方法同2.1.3(定容體積的影響引入的不確定度u(V))，u1(V0)=0.32%；②200.0 ml單標(biāo)線容量瓶引起的不確定度u2(V0)，200.0 ml單標(biāo)線容量瓶，示值允差±0.10 ml，重復(fù)性±0.10 ml，按均勻分布屬B類，取k=3，玻璃的膨脹系數(shù)為1.5×10-5/℃計(jì)算方法同上，u2(V0)=0.081%；③10.0 ml單標(biāo)線容量瓶引起的不確定度u3(V0)，10.0 ml單標(biāo)線容量瓶示值允差±0.02 ml，估讀重復(fù)性±0.01 ml，按均勻分布屬B類，取k=3，玻璃的膨脹系數(shù)為1.5×10-5/℃，計(jì)算方法同上，u3(V0)=0.14%，

2.1.5 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度

直線擬合為最常用、最簡(jiǎn)單的一種，其給出兩個(gè)變量x、y間的線性關(guān)系。通過測(cè)量出一組數(shù)據(jù)(xi，yi)(i=1，2，…n)，得到的一條直線y=bx+a，所有這些點(diǎn)(xi，yi)與這條直線垂直距離之差的平方和最小，即所謂的最小二乘法。

(1)擬合過程。采用6個(gè)濃度水平的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定2次，得到相應(yīng)的峰面積(y)，用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到直線方程和相關(guān)系數(shù)y=19152.2C0+2216.2，r=0.9995(C0為質(zhì)量濃度，y1為第一次測(cè)量的峰面積，y2為第二次測(cè)量的峰面積，y為計(jì)算值)，見表1。

表1 最小二乘法擬合甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度、峰面積值結(jié)果

(2)曲線擬合帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C)其計(jì)算為公式14：

式中SR為回歸曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差(殘差的標(biāo)準(zhǔn)差)；b為斜率(b=19152.2)；p為待測(cè)樣品的重復(fù)測(cè)定次數(shù)(p=6)；n為回歸曲線的點(diǎn)數(shù)(n=12)；為待測(cè)樣品濃度的平均值(32.72μg/L)；0為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度值；C0j為各標(biāo)準(zhǔn)液濃度值。

剩余標(biāo)準(zhǔn)差SR，也稱均方差，在線性回歸分析中，真實(shí)值和估計(jì)值之間的差稱為殘差，所有預(yù)測(cè)值的殘差平方和(或者剩余平方和)，剩余標(biāo)準(zhǔn)差就是剩余平方和的開平方。用來表示估計(jì)值的精度，其計(jì)算為公式15：

式中A0J為各標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積值；a+bC0為根據(jù)回歸曲線算出來的理論值。

對(duì)樣品測(cè)定液進(jìn)行6次測(cè)量，由直線方程求得平均質(zhì)量濃度：

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)帶來的相對(duì)不確定度計(jì)算為公式16：

2.1.6 結(jié)果重復(fù)性帶來的不確定度

在重復(fù)性條件下，對(duì)魚肉樣品進(jìn)行了6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，測(cè)得甲基汞的含量分別為821.11、824.64、811.03、824.62、813.60及812.64，則甲基汞含量的算術(shù)平均值計(jì)算為公式17：

單次測(cè)量的不確定度計(jì)算為公式18：

算數(shù)平均值的不確定度計(jì)算為公式19：

測(cè)量結(jié)果的相對(duì)不確定度計(jì)算為公式20：

2.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(i )

無論是通過A類還是B類評(píng)定方法得到各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量后，將各標(biāo)準(zhǔn)不確定分量合成以得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，各不確定度分量見表2。

表2 各不確定度分量

表2顯示，對(duì)測(cè)量不確定度影響最大的分量是樣品制備過程，其次是配置標(biāo)準(zhǔn)系列所產(chǎn)生的不確定度。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為公式21：

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果：

2.3 擴(kuò)展不確定度

擴(kuò)展不確定度是確定測(cè)量結(jié)果區(qū)間的量，合理賦予被測(cè)量之值分布的大部分可望含于此區(qū)間，其計(jì)算為公式22：

計(jì)算結(jié)果：U=52.51μg/L×2=105.02μg/L。

2.4 報(bào)告結(jié)果

樣品報(bào)告結(jié)果為甲基汞含量的算術(shù)平均值加減擴(kuò)展不確定度，其計(jì)算為公式23：

計(jì)算結(jié)果：ω=(817.94±105.02)μg/L。

3 結(jié)論

本研究報(bào)告的測(cè)量不確定度是在最佳儀器條件下得到的結(jié)果，即各被測(cè)組分有效分離、共存物質(zhì)不干擾及實(shí)驗(yàn)室溫度恒定在實(shí)際測(cè)定時(shí)嚴(yán)格按照測(cè)定的要求進(jìn)行[6-8]。通過不確定度分析發(fā)現(xiàn)，用液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定魚肉中甲基汞，不確定度的主要來源是樣品制備、標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)方法以及結(jié)果的重復(fù)測(cè)定[9-10]。其中對(duì)測(cè)量不確定度影響最大的分量是

樣品制備過程，其次是配置標(biāo)準(zhǔn)系列所產(chǎn)生的不確定度。樣品制備過程引起的不確定度主要來自樣品的提取過程，配置標(biāo)準(zhǔn)系列所產(chǎn)生的不確定度主要來自標(biāo)準(zhǔn)液的配置過程。應(yīng)用本方法對(duì)液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定魚肉中甲基汞含量的進(jìn)行不確定度分析，使測(cè)定結(jié)果更加可靠。

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