不同病原菌脅迫下青蛤血淋巴轉錄組中免疫相關基因的比較

趙婷 潘寶平

摘要 利用病原微生物革蘭氏陽性藤黃微球菌（Micrococcus luteus）和革蘭氏陰性鰻弧菌（Vibrio anguillarum）分別侵染活體青蛤，采用第二代測序MiSeq技術測序，構建了青蛤血淋巴中應答2種病原物的轉錄組文庫。根據KEGG等數據庫注釋信息對Unigene進行生物學通路注釋，預測出青蛤免疫信號通路的差異性表達基因及相關注釋信息。結果發現，共注釋并篩選出2 605個差異表達基因，其中893個基因注釋到15個免疫相關的通路中。該研究可為探索青蛤的免疫識別方式和信號傳導路徑提供依據。

關鍵詞 青蛤；轉錄組文庫；鰻弧菌；藤黃微球菌；免疫相關基因

中圖分類號 S917.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）27-0084-04

Comparison of Immunerelated Genes in Transcriptome Library of Cyclina sinensis Hemolymph under the Stress of Different Pathogenic Bacteria

ZHAO Ting1， PAN Baoping2

（1.Tianjin Medical College， Tianjin 300222；2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， College of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387）

Abstract Cyclina sinensis were injected with Micrococcus luteus and Vibrio anguillarum respectively.

Using the Illumina Miseq system of secondgeneration sequencing technology， two transcriptome library of hemolymph was constructed. Unigene could be annotated to biological pathway by KEGG database to predict differential expression network of immune signaling pathway in C. sinensis. The results showed that 2 605 differentially expressed genes were found and a total of 893 genes annotated to 15 immune related pathways. This research could provide basis for exploring immune recognition and signal transduction pathway in C. sinensis.

Key words Cyclina sinensis；Transcriptome library；Vibrio anguillarum；Micrococcus luteus；Immunerelated genes

基金項目 天津市科委應用基礎與前沿技術重點項目（12JCZDJC22800）。

作者簡介 趙婷（1988—），女，山東煙臺人，助教，碩士，從事生物化學與分子生物學研究。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事軟體動物分子系統學、海產貝類養殖與病害防治工作。

收稿日期 2018-06-05

青蛤養殖是我國傳統的海濱經濟產業，蘊含著巨大的發展前景[1]。近年來，由于青蛤養殖產業中出現的高密度投放、種質退化及養殖環境污染等問題，屢次發生病害及大面積死亡現象，給青蛤養殖業造成了巨大的經濟損失[2-4]，有關貝類病害問題已成為制約貝類養殖業持續發展的重要因素之一。青蛤的病害防治應從外因和內因2個方面入手，外因方面要求改善貝類的養殖環境，內因方面則要求提高貝類自身的抗病能力，即通過分子免疫學技術尋找物種的免疫相關基因和探索免疫應答機制，最終揭示貝類的免疫調控分子機制并為抗病品系選育提供有價值的數據。

目前，有關貝類轉錄組的研究已成為貝類免疫學研究的熱點，亦成為研究者獲得大量免疫抗病基因的有效途徑之一。Hou等[5]通過454 高通量測序方法對蝦夷扇貝成體各組織和各發育階段的轉錄組進行分析，一些與免疫、抗逆性、生長和繁殖相關的基因被發現，為蝦夷扇貝的基因組研究和遺傳提供重要的平臺。Huan等[6]將文蛤不同發育階段的幼蟲進行轉錄組測序，分析了文蛤 4 個幼蟲發育階段的表達差異，通過對序列拼接及基因功能注釋，發現與生長、發育及免疫相關的基因。結合文獻檢索結果和GenBank中注冊青蛤EST的情況可知，國內外對青蛤免疫功能基因的研究剛剛起步[7]，因此構建青蛤轉錄組文庫大規模進行測序是十分必要的。筆者采用第二代測序技術對在不同病原物刺激下的青蛤血淋巴轉錄組進行了比較，以期為揭示青蛤的免疫應答與免疫調控機制提供有價值的數據，同時也為青蛤養殖實踐中的病害防治策略提供新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從天津大港海灘沿岸采集的青蛤作為試驗材料，隨機選取沒有損傷、形態大小一致的青蛤樣品，暫養于通氧氣的海水中，海水密度約1.030 g/cm3，溫度保持在22 ℃左右，海水pH 7.0，投喂5‰的小球藻，7 d后做建庫試驗準備。

1.2 試驗方法

1.2.1 侵染試驗。

鰻弧菌在28 ℃條件下用2216E大量培養菌株，藤黃微球菌在37 ℃條件下用LB大量培養菌株，分別進行菌液制備。24 h后菌液渾濁，經轉速3 000 r/min離心10 min，將2種菌體分別用過濾滅菌的海水清洗3次，去除多余殘留培養基，用同樣海水重新懸浮菌體，OD600控制在04。隨機抽樣12只健康青蛤，備用于制備轉錄組測序樣品。然后，采用隨機分組的方式分成鰻弧菌刺激組和藤黃微球菌刺激組。在閉殼肌內分別注射等量的菌懸液，分別在注射后6和12 h后取青蛤血淋巴。血淋巴在4 ℃條件下，8 000 r/min離心10 min收集血細胞，加入1 mL Trizol，置于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 青蛤轉錄組文庫的構建。

采用Trizol法提取青蛤血淋巴總RNA，產物使用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits進行分離與純化。純化后加入裂解緩沖液將mRNA打斷成短的片段，采用隨機引物逆轉錄合成cDNA。純化的雙鏈cDNA再經末端修復、加A尾、加測序接頭、連接產物純化、PCR富集接頭連接DNA等步驟完成整個文庫的制備。利用Life Tech（Invitrogen）Qubit 2.0熒光計及生化分析儀（Agilent 2100高靈敏度芯片）檢測文庫質量，檢測流程參照其說明書。經質量檢測合格的文庫使用Illumina MiSeq測序儀上進行pair end雙端模式（PE250）測序。

1.2.3 原始數據的預處理及拼接組裝。

測序后得到原始圖像數據轉化成序列數據（Raw data 或 Raw reads），原始測序數據中包含接頭信息、低質量堿基和未測出的堿基，通過深度質量控制（QC）過濾篩選，最終得到的數據即為有效數據（Clean data或Clean reads）。統計原始測序數據量以及經過堿基質量控制處理后reads平均長度、reads總數目和總數據量產出等信息。根據樣本經過質量控制分析所保留下來的測序reads數據進行樣本轉錄組拼接組裝。利用Trinity生物分析軟件將短的讀長拼接，得到組裝片段（Contig），將Contig互相拼接，最后得到具有一定長度的非冗余Unigene。

1.2.4 Unigene Pathway生物通路注釋。

KEGG是系統研究基因的生物代謝途徑和相關基因功能的大型數據庫，利用KEGG數據庫對合并拼接的Unigene進行Pathway生物學通路的注釋和預測。通過KEGG pathway注釋，對免疫相關基因數目進行統計。

1.2.5

差異基因的篩選及表達量分析。

將拼接序列與基因組序列比對，利用編碼RNA表達計算，這是通過統計方法估計的表達量，也用于后續樣本差異表達量比較分析。RNA表達量的計算采用FPKM計算度量指標。表達量的計算有多種標準化方法，采用參考基因區域內匹配read標準化模式（cufflink軟件）計算表達量與差異基因表達。

針對isoform（即Unigene）以及gene（即components）分別進行表達量計算。表達量用PFKM表示，并給出unigene對應NR與Uniprot蛋白數據庫的最佳匹配結果作為其注釋。表達差異分析就是組間差異表達譜分析。差異分析可分別對基因（gene FPKM）和基因異構體（isoform FPKM，即components）層面分別進行考慮計算。差異分析采用edgeR軟件，在R軟件環境下實現。表達量差異倍數大于2（FPKM≥2）且FDR<10-5作為篩選標準。

1.2.6 Unigene差異表達基因GO功能分析。

分別對Unigene進行gene以及isoform差異結果的GO富集度分析。GO功能聚類常用于對目標組基因進行功能注釋與分類。全部或差異mRNA/基因功能聚類（富集度）分析是采用GO注釋系統，功能注釋針對全部差異mRNA結果展開。富集度分析采用超幾何分布算法和并采用多重假設檢驗校驗超幾何分布統計量的P值，獲得校正后P值，即q值。

2 結果與分析

2.1 測序數據量統計

對青蛤被藤黃微球菌刺激的樣本（樣本T）進行測序，共獲得12 916 040條Raw reads，去除低質量的和載體序列等，共10 966 322條Clean reads（表1）。青蛤被鰻弧菌刺激的樣本（樣本M）測序，共獲得15 930 210條Raw reads，去除低質量的和載體序列等，共13 389 388條Clean reads（表2）。樣本T的測序原始數據量為3.22 G，平均Q20為88.62 %，GC含量平均值為43.10%；樣本M的測序原始數據量為3.98 G，平均Q20為87.72 %，GC含量平均值為42.67%。轉錄組測序質量高，建庫成功。

2.2 轉錄組測序數據的組裝拼接效果統計

M樣本轉錄組序列組裝拼接完成的總轉錄本數量為148 238條，拼接完成的總基因數量為62 152條，轉錄本長度均值（average contig）約618.50 bp。T樣本轉錄組序列組裝拼接完成的總轉錄本數量為137 940條，拼接完成的總基因數量為57 877條，轉錄本長度平均值（average contig）約644.32 bp。

2.3 免疫相關基因數目統計

通過KEGG pathway注釋（E值≤10-5作為篩選標準），共893個基因注釋到15個免疫相關pathway，T細胞受體信號通路的免疫防御基因居多，其次是趨化因子信號通路，白細胞跨內皮遷移，FcγR介導的吞噬作用及Toll樣受體信號通路中也包含大量免疫防御相關基因（表3）。經序列同源性比較、功能基因注釋和代謝途徑分析，此次轉錄組測序中發掘青蛤免疫防御系統的相關抗病因子，主要有熱冷休克蛋白家族、親環素、非消化性的酶和酶抑制劑家族、抗菌肽家族、Toll樣受體家族及其下游信號因子等。

2.4 Unigene差異表達分析

由圖1可知，青蛤經過革蘭氏陽性菌藤黃微球菌和革蘭氏陰性菌鰻弧菌的分別刺激，共得到2 605個差異表達基因，其中1 091個基因樣品M中上調表達（樣品T中下調）和1 514個基因在樣品T中上調表達（樣品M中下調）。

2.5 差異表達基因Pathway功能富集分布

由圖2可知，共1 942個差異基因被注釋到KEGG并顯著富集到110個pathway。差異基因主要集中在以下通路：亨廷頓氏病、帕金森病、非酒精性脂肪性肝病、抗原加工提呈、類風濕性關節炎。差異基因被富集到110個pathway中，有11個pathway與免疫相關（該研究中有15個與免疫相關pathway被注釋到）。它們分別為造血細胞譜系、補體系統、Toll樣受體信號通路、RIG-I樣受體信號通路、自然殺傷細胞介導細胞毒性、抗原加工提呈、B細胞受體信號通路、FcεRI信號通路、FcγR-介導吞噬、白細胞跨內皮遷移、趨化因子信號通路。

3 討論與結論

青蛤是具有高經濟價值的海洋經濟動物，近年來研究表明，引發青蛤養殖大規模病害和死亡的最主要因素是病原菌

的感染[8]。目前研究表明微球菌可以引發水產動物發生疾病，如變異微球菌（Micrococcus varians）是牙鲆出血病的病原菌，患病牙鲆會表現出上下頜出血發紅，體表彌散性出血。與水產動物病害相關的革蘭氏陽性菌廣泛分布并造成大面積病害，如藤黃微球菌（Micrococcus luteus）分散在水、土壤、空氣、植物和動物表面，一般會引起傷口等局部組織的感染，也可能會引起嚴重感染[9-10]。彭彬等[11]從患出血性疾病的黃鱔體內首次分離到藤黃微球菌，這也是首次在水生動物體內分離到病原菌藤黃微球菌。革蘭氏陽性菌生長過程中細胞會分泌外毒素，會引起機體的免疫反應，一定時間內大量免疫活性物質活性將在一定程度上升。鰻弧菌（Vibrio anguillarum）是青蛤疾病的重要病原微生物，鰻弧菌的致病性與其自身的一些有毒物質有關[12]，在脂多糖、胞外蛋白酶、溶血素等許多毒力因子的共同作用下，引發青蛤大規模病害甚至死亡的現象[13]。弧菌的致病過程首先通過吸附宿主細胞，侵入細胞中，在體內大量進行增殖，發出有毒的物質進而導致宿主死亡[14]。筆者所在課題組前期研究表明一定濃度的鰻弧菌脅迫青蛤后，其會產生大量免疫相關的活性物質，相關免疫基因的表達也會發生一定程度的上調[15-17]。

為深入探索導致貝類病害和死亡的主要病原細菌及動物的抗逆機制，國內外對于貝類轉錄組的研究已有報道[18]，包括對多種經濟貝類進行了高通量測序，均獲得了大量的EST 序列。貝類免疫系統中的免疫防御相關的抗病因子，包括免疫識別信號Toll樣受體因子及其免疫信號通路以及下游的熱休克蛋白、親環素、非消化性的酶和酶抑制劑、抗菌肽等，為探索貝類免疫應答方式、免疫識別防御系統及其調控網絡提供了大量有價值的實驗數據。該研究利用第二代高通量測序技術對青蛤的血淋巴細胞的轉錄組文庫進行建庫及注釋分析，在確保獲得的轉錄組拼接結果良好的條件下，共篩選到893個免疫相關基因，并將其注釋到15個免疫相關的信號通路中。綜合序列同源性比較和功能基因注釋信息，發現青蛤多種免疫防御相關抗病基因，特別是在Toll樣受體信號通路中，MyD88樣轉接蛋白（Mal）、Trif 相關轉接分子（TRAM）、泛素連接酶（TRAF6），轉錄因子 NF-κB及抑制物 IκB等免疫相關基因在此次青蛤轉錄組測序中首次被拼接和注釋到，為后續研究青蛤Toll信號通路信號傳導機制奠定重要基礎[19]。

在水產動物的免疫研究中，采用外界病原生物刺激的方法獲得大量差異表達基因，這為后期綜合分析其免疫應答方式和免疫防御提供數據支持。Astrofsky等[20]將白斑病毒感染后的藍蝦與健康藍蝦進行基因表達差異比較，獲得32個差異表達基因，其中某些差異表達基因與提高藍蝦抗病能力密切相關，該研究為選育抗病品種奠定堅實基礎。Huvet等[21]利用亮弧菌分別刺激抗性牡礪和易感性牡礪，通過基因表達的比較分析，共獲得150個差異表達基因，經分析抗性牡礪和易感性牡礪存在免疫防御功能方面存在差異。該研究利用革蘭氏陽性菌和陰性菌刺激青蛤后，從構建的轉錄組文庫中拼接獲得了2 605個差異表達基因。在上述差異表達基因中，有1 091個基因在樣品M中上調表達（相對于樣品T），而1 514個基因在樣品T中上調表達（相對于樣品M）。此外，通過對差異基因Pathway功能富集，其中共有1 942個差異基因顯著富集到110個通路中，其中有11個pathway跟免疫相關。上述試驗結果表明青蛤為應答不同病原物的入侵，不同免疫因子參與免疫應答反應，而特定基因的差異性表達證明其對于革蘭氏陽性菌和陰性菌的識別和清除作用有一定的差異。綜上所述，該研究結果為后期研究青蛤的先天性免疫的應答機制以及病害防治提供新途徑。

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