蚯蚓體內外分泌液的抗菌活性研究

2018-05-14 08:59:45張顯忠張欣然武曉雯袁燕濤郭東會

安徽農業科學 2018年13期

張顯忠　張欣然　武曉雯　袁燕濤　郭東會

摘要 [目的] 探究蚯蚓體內外分泌液的抗菌活性。[方法]分別將蚯蚓體內外分泌液作用于不同的臨床致病菌株，篩選對體內外分泌液的敏感菌種，并在此基礎上分析溫度、pH、蚯蚓體內外分泌液濃度等因素對蚯蚓分泌液抗菌效果的影響。[結果] 蚯蚓體內外分泌液均對金黃色葡萄球菌有良好的抗菌效果；誘發最佳抗菌效果的環境條件為：內分泌液原液、30 ℃、pH 7～8；外分泌液原液、60 ℃、pH 7～8。[結論]研究結果為更好地開發與利用蚯蚓資源提供了理論基礎和實踐依據。

關鍵詞蚯蚓；分泌液；抗菌效果；金黃色葡萄球菌

中圖分類號 S899.8 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）13-0095-03

Study on the Antibacterial Activity of Internal and External Secretory Fluid of Earthworm

ZHANG Xianzhong，ZHANG Xinran，WU Xiaowen et al

（School of Life Sciences，Taishan Medical University，Tai′an，Shandong 271000）

Abstract [Objective] To study the antibacterial activity of the internal and external secretory fluid of earthworm.[Method] The internal and external secretory fluid of earthworms were conducted on different clinical pathogens to screen out sensitive strains of internal and external secretory fluids .On this basis，the influences of temperature，pH，the concentration of internal and external secretory fluid of earthworms and other environmental factors on the antibacterial effect of secretory fluid of earthworm were analyzed.[Result] The internal and external secretory fluids of earthworm had good antibacterial effects on Staphylococcus aureus.The environmental conditions to induce the optimum antibacterial effect were as follows：the original liquid of the internal secretory fluid，30 ℃，pH 7-8；the original liquid of external secretory fluid，60 ℃，and pH 7-8.[Conclusion] The research results provided theoretical basis and practical basis for better exploitation and utilization of earthworm resources.

Key words Earthworms；Secretory fluid；Antibacterial effect；Staphylococcus aureus

蚯蚓通常生活在具有大量致病微生物的環境中，生命力極強且很少患病[1]。蚯蚓不僅作為分解者在生態系統中占有重要地位，降低工業造成的環境污染，保護生態環境，實現農業的可持續發展[2]，同時由于體內存在多種抗菌成分，當受到機械、電擊、化學及熱刺激時分泌的黃色分泌液中也含有抗菌肽等活性成分，具有較強的抑菌活性[3]。因此，蚯蚓不僅可作為優質的動物蛋白應用于生產生活中，而且毒副作用小，在當今抗藥性細菌泛濫的背景下更加安全環保的蚯蚓分泌液有望替代抗生素，具有巨大的生化藥理潛力。筆者通過敏感性測定試驗篩選出對蚯蚓體內外分泌液的敏感菌種，并分析了蚯蚓分泌液的抗菌效果以及環境因素對其影響，以期為更好地開發與利用蚯蚓資源提供理論基礎和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），購自眾翔蚯蚓養殖專業合作社。大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌，均由泰山醫學院附屬醫院微生物實驗室提供。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓外分泌液的提取。取蚯蚓250 g，用清水反復沖洗，浸泡30 min，以便吐凈泥沙；再用無菌蒸餾水沖洗3～5次，用濾紙吸取體表多余水分。將蚯蚓于60 ℃水浴條件下熱刺激5～10 s[4]，待分泌出黃色分泌液后收集轉移至無菌50 mL離心管中，20 000 r/min離心10 min，取上清液，重復離心1次后，用一次性針式濾器過濾備用。

1.2.2 蚯蚓內分泌液的提取。取已提取外分泌液的蚯蚓250 g，瀝干體表水分，-12 ℃下預冷處理20 min，勻漿器研磨，將液體經3層紗布過濾于50 mL離心管中，20 000 r/min離心10 min，取上清液，重復離心1次后，用一次性針式濾器過濾備用。

1.2.3 不同菌株對蚯蚓分泌液的敏感性測定。取直徑5 mm的藥敏專用濾紙片，高壓滅菌干燥。吸取50 μL內（外）分泌液，滴于濾紙片上。制備大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌，菌液濃度均為15×108個/mL，分別涂布于MH培養基[5]，并將上述含分泌液的濾紙片均勻貼到培養基上。置于恒溫培養箱中37 ℃培養18～20 h，試驗重復3次，觀察并測量抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.4 不同溫度對分泌液抗菌效果的影響。采用熱刺激法提取蚯蚓外分泌液，設置外分泌液的溫度梯度分別為60、70、80、90、100 ℃；內分泌液于室溫條件下提取，因此溫度梯度設置為30、40、50、60和70 ℃。

取5支10 mL無菌離心管，各加入蚯蚓外分泌液600 μL，分別在60、70、80、90、100 ℃下加熱10 min[6]。吸取50 μL各溫度梯度的外分泌液，滴于濾紙片上。將蚯蚓分泌液敏感菌株涂布在培養基上，濾紙片置于其中，每個培養基上做5個梯度，設置3次重復試驗，觀察并測量抑菌圈的直徑，取平均值。另取5支10 mL無菌離心管，各加入蚯蚓內分泌液600 μL，分別在30、40、50、60和70 ℃下加熱10 min。吸取50 μL各溫度梯度的內分泌液，操作同上，觀察并測量抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.5 不同濃度對分泌液抗菌效果的影響。排列6支試管，分別標記為1～6，1號試管僅加入600 μL蚯蚓內（外）分泌液作為對照，2～6號試管采用倍比稀釋法[7]進行稀釋，濃度依次稀釋2、4、8、16、32倍，吸取50 μL各濃度梯度內（外）分泌液，滴于濾紙片上。將濾紙片置于涂布有敏感菌的培養基上，每個培養基做5個梯度，設置3次重復試驗。觀察并測量抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.6 不同pH對分泌液抗菌效果的影響。配制不同pH緩沖溶液（pH 5的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH分別為6、7、8的PBS緩沖液，pH 9的碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液[8]；取各pH梯度緩沖液600 μL與蚯蚓內（外）分泌液等量混合。吸取50 μL各pH梯度的內（外）分泌液，滴于濾紙片上。將濾紙片置于涂布有敏感菌株的培養基上，每個培養基上做5個梯度，設置3次重復試驗。觀察并測量抑菌圈直徑，取平均值。

2 結果與分析

2.1 不同菌株對蚯蚓分泌液的敏感性測定由圖1可知，對蚯蚓內、外分泌液最敏感的菌種均為金黃色葡萄球菌[9]，肺炎克雷伯菌效果次之，大腸埃希氏菌第三，而弗氏檸檬酸桿菌沒有任何現象產生。作用于同一菌種時，內分泌液抑菌圈直徑均大于外分泌液抑菌圈直徑。究其原因，應是由于提取方法不同所致。提取外分泌液時，水浴加熱可能破壞其中一部分有效成分，導致外分泌液的抑菌效果普遍稍弱于內分泌液。

2.2 不同溫度對分泌液抗菌效果的影響從圖2可以看出，對于內分泌液，30～50 ℃時均有抑菌圈出現，其中30 ℃時抑菌圈最大，隨著溫度的升高，抑菌圈逐漸縮小，60 ℃時抑菌圈已完全消失。究其原因，可能是因為蚯蚓為變溫動物，體溫會隨著外界環境的變化而上下波動，有一定的耐受范圍，但隨著溫度的持續上升，高溫會破壞有效成分的結構，導致抗菌能力消失[10]。從圖3可以看出，對于外分泌液，60～100 ℃時均有抑菌圈出現，60 ℃時抑菌圈最大，隨著溫度的升高，抑菌圈逐漸縮小。究其原因，可能是因為高溫破壞了部分有效成分的結構，使抑菌效果變差，但總體來看，外分泌液的熱穩定性相對較高，當溫度升至100 ℃時仍保留了部分抑菌活性。內外分泌液對溫度表現出這樣的差異，可能是蚯蚓在漫長的進化過程中與環境相互作用而逐步形成的，是自然選擇的結果[11]。

2.3 不同濃度對分泌液抗菌活性的影響從圖4可以看出，蚯蚓內、外分泌液均為蚯蚓原液的抑菌效果最明顯，

抑菌圈隨濃度的降低而逐漸縮小，至32倍時幾乎不可測，且同樣濃度的內分泌液抑菌圈直徑略大于外分泌液。究其原因，可能與內、外分泌液不同的提取方式有關[12]。

2.4 不同pH對分泌液抗菌活性的影響從圖5可以看出，當pH為5、7、8時蚯蚓內外分泌液抑菌圈直徑較大，pH為6和9時抑菌圈直徑較小。究其原因，pH 7～8的環境與蚯蚓生活的土壤所需pH相近[13]，因此內外分泌液的抗菌效果達到最大，而pH為5時出現一個明顯的峰值，可能與緩沖液本身有關，較低的pH抑制了金黃色葡萄球菌的生長，對內外分泌液的抑菌產生一定的干擾。當pH為9時，外分泌液的抑菌圈均略大于內分泌液的抑菌圈，可能是由于內分泌液比外分泌液對外界pH的改變更加敏感所致。

3 討論與結論

該研究改變了通過在恒溫箱內長時間溶解來獲取蚯蚓內分泌液的傳統方法，采用低溫勻漿器研磨，將溫度對蚯蚓內分泌液中活性成分的影響降至最低，另外采用一次性針式濾器過濾蚯蚓分泌液，很大程度上排除了外源微生物對試驗的干擾，提高了試驗結果的準確性。該研究證實了蚯蚓體內外分泌液都具有較強的抑菌效果，但由于采用熱刺激法[14]提取蚯蚓外分泌液，一定會造成蚯蚓外分泌液中抗菌活性物質的損失，總之蚯蚓內分泌液的抗菌效果強于外分泌液，也從側面說明了溫度對蚯蚓分泌液抗菌效果的影響巨大。誘發蚯蚓分泌液發揮最大抗菌效果的環境條件如下：在30 ℃， pH 7～8時，蚯蚓內分泌液原液的抗菌效果最佳；在60 ℃，

pH為7～8時，蚯蚓外分泌液原液的抗菌效果最佳。綜上所述，不論是在生產中還是生活中，在對蚯蚓分泌液進行開發利用時，應特別注意外部理化因素尤其是溫度對其帶來的干擾，選擇最優條件，使其發揮出最大作用。

參考文獻

[1]

賈久滿，朱蓮英，石洪凌.蚯蚓水解液對大腸桿菌的抑菌效果[J].安徽農業科學，2007，35（4）：969，971.

[2] 張希春，孫振鈞，禚如朋，等.蚯蚓兩種抗菌肽的分離純化及部分性質[J].生物化學與生物物理進展，2002，29（6）：955-960.

[3] 賈久滿，李成會，張連忠.蚯蚓浸出液對大腸桿菌抑菌效果的研究[J].飼料工業，2006，27（22）：60-61.

[4] 賈久滿，鄭素玲，李成會.蚯蚓水解液與浸出液對大腸桿菌的抑菌效果[J].飼料研究，2007（10）：3-4.

[5] 郭志堅，郭書好，何康明，等.黃柏葉中黃酮醇甙含量測定及其抑菌實驗[J].暨南大學學報（自然科學版），2002，23（5）：64-66.

[6] 呂春梅，王琨，邱海龍，等.稀土硝酸鹽對金黃色葡萄球菌抑菌活性實驗[J].哈爾濱工業大學學報，2005，37（12）：1639-1640.

[7] 常翠，董淳，楊宏圖，等.清喉口含片動物體內、外抑菌實驗研究[J].中國藥房，2006，17（5）：336-338.

[8] 黃敏，顏冰楠，桂新春.酶的pH影響實驗中緩沖液配制的改善與優化組合[J].職業教育研究，2012（8）：136-137.

[9] 劉兵，夏先林，施曉麗.蚯蚓體腔液對大腸桿菌抑菌效果試驗[J].黑龍江畜牧獸醫，2008（11）：92-93.