綠豆核酸酶的提取及活力測定

胡敏

摘要 [目的]優化綠豆核酸酶的提取條件并測定其活力。[方法]利用單因素和正交試驗，考察提取時間、料液比、pH、芽長幾個因素對從綠豆芽中提取核酸酶的影響，優選出各影響因素的最佳水平，并進行活力測定。[結果]提取時間20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽長是綠豆長的4倍時，綠豆核酸酶酶活最高為478.86 U/ mL 。影響綠豆核酸酶提取的因素主次順序依次為提取時間、pH、料液比、芽長。采用飽和度為80%的硫酸銨鹽析沉淀后，酶活達 1 569.6 U/ mL ，較提純前提高了2.28倍。[結論]該研究可為核酸酶的開發利用提供參考。

關鍵詞 綠豆；核酸酶；提取；活力

中圖分類號 S522 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）02-0149-03

Abstract [Objective]To optimize the extraction conditions of mung bean nuclease and determine its vitality.[Method]Single factor and orthogonal experiments were used to investigate the effects of extraction time，material to liquid ratio，pH and bud length on the extraction of nuclease from mung bean sprouts.The best level of each influencing factor was selected and the activity was determined.[Result]The extraction time was 20 h，the solidliquid ratio was 1∶12（g∶mL），pH 3，and the bud length was 4 times the length of mung bean，and the maximum activity of the mung bean nuclease enzyme was 478.86 U/ mL.The main and secondary factors affecting the extraction of mung bean nuclease are extraction time，pH，ratio of material and liquid，and length of bud.After precipitation of ammonium sulfate with saturation of 80%，the enzyme activity reached 1 569.6 U/ mL，which was 2.28 times higher than that before purification.[Conclusion]This study can provide reference for the development and utilization of nuclease.

Key words Mung bean； Nuclease； Extraction； Activity

核酸酶作用于核酸鏈中的磷酸二酯鍵。不同來源的核酸酶，可能具有不同的分子結構和催化性能[1-2]。核酸酶可以從毒蛇的毒汁、綠豆芽、麥芽根中提取得到，也可以利用桔青霉生產。

綠豆核酸酶是來源于綠豆芽的5′-磷酸二酯酶，可將單鏈DNA水解為5′端帶磷酸基團的單核苷酸或寡核苷酸[3]。雙鏈DNA、雙鏈RNA及DNA與RNA雜交鏈對此酶相對不敏感，但此酶量大時也能將雙鏈核酸完全降解。作用的最適pH為5.2～5.4[4]，最適溫度37 ℃，需要Zn2+、乙二胺四乙酸（EDTA）為抑制劑，0.01%十二烷基磺酸鈉（SDS）（pH 5.0）能夠使酶完全失活[5]。

目前，核酸酶可用作食品添加劑、生化藥物，在農業上可作為植物生長劑[6]，在飼料上用作高效安全的添加劑[7]，也可用于各種調味品[8]、功能性食物、核酸強化食品、保健品的生產[9]。采用磷酸二酯酶水解RNA法生產5′-核苷酸是目前核苷酸生產的主要方法。從世界整體情況來看，核苷酸總體上供不應求，在全球范圍內屬于緊缺產品，市場前景良好。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：綠豆。主要儀器：752N紫外可見分光光度計、PDZ5-WS低速自動平衡離心機、HHS型電熱恒溫水浴鍋、PHS-25型數顯酸度計。主要試劑：硫酸銨、醋酸鈉、醋酸、氯化鈉、硫酸鋅、甘油、高氯酸、大腸桿菌菌液、裂解液、苯酚、氯仿、無水乙醇、70%乙醇、RNaseA、ddH2O。

1.2 方法

1.2.1 綠豆預處理。稱取綠豆200 g，清洗5遍裝入燒杯中，用5層紗布覆蓋，加入25 ℃溫水浸泡。每2 h淋一次水，待豆芽長到要求長度取出待用[10]。

1.2.2 底物DNA的制備。取1.5 mL大腸桿菌菌液，離心，棄上清，加入40 μL裂解液，37 ℃水浴30 min。加入132 μL氯化鈉，離心，取上清置新離心管中。加入300 μL苯酚和300 μL氯仿，混勻，離心，取上清置新離心管中。加入600 μL氯仿，離心，取上清置新離心管中。加入800 μL無水乙醇，-20 ℃靜置10 min，離心，棄上清。加入300 μL 70%乙醇清洗，晾干，加入2 μL RNaseA、30 μL ddH2O，使用濃度純度分析儀在波長260 nm處測定底物DNA濃度。置于4 ℃冰箱備用[11-12]。底物也可選用長春花基因組DNA。

1.2.3 單因素試驗。

1.2.3.1 提取時間對綠豆核酸酶提取的影響。

取綠豆芽4 g，在冰上研磨加入0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（含0.1 mol ZnSO4），分別提取4、8、12、16、20、24、28、32 h。過濾棄濾渣，濾液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min離心取上清，分別測定其核酸酶活力。

1.2.3.2 料液比對綠豆核酸酶提取的影響。

取綠豆芽4 g，在冰上研磨分別加入8、16、24、32、40、48、56、64 mL的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（含0.1 mol ZnSO4），使料液比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16（g/mL）。過濾棄濾渣，濾液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min離心取上清，分別測定其核酸酶活力。

1.2.3.3 pH對綠豆核酸酶提取的影響。

取綠豆芽4 g，在冰上研磨分別加入pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（含0.1 mol ZnSO4）。過濾棄濾渣，濾液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min離心取上清，分別測定其核酸酶活力。

1.2.3.4

芽長對綠豆核酸酶提取的影響。分別取芽長為綠豆長度1、2、3、4、5、6、7、8倍的綠豆芽4 g，在冰上研磨加入0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（含0.1 mol ZnSO4）。過濾棄濾渣，濾液65 ℃水浴15 min，離心取上清，分別測定其核酸酶活力。

1.2.4 綠豆核酸酶活力的測定。

取甲乙2支2 mL離心管，分別加入稀釋5倍、濃度為1.8 μg/mL的底物DNA 50 μL和pH 5.0的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液40 μL，于65 ℃水浴中預熱10 min，然后在甲管中加入10 μL酶液，繼續保溫10 min。甲乙兩管再分別加入高氯酸溶液（2.5%）100 μL[13-14]，乙管補加10 μL酶液，冷卻放置15 min，3 500 r/min離心15 min，取上清。在波長260 nm處測OD260。以先加高氯酸的離心管為對照，在上述條件下，每1 min形成的核苷酸能使波長260 nm處的光密度差為1.0的量，定義為1個酶活單位。計算公式如下：

酶活力=（OD260甲-OD260乙）×1.8/10 （1）

1.2.5 正交試驗。通過對料液比、提取時間、pH、芽長單因素的研究，選擇4個合適的水平，進行4因素4水平的正交試驗。

1.2.6 綠豆核酸酶粗酶液的提純。

1.2.6.1 硫酸銨分級沉淀。取2 mL正交試驗最優組合的粗酶液分別加入8 mL 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸銨溶液，靜置48 h。

1.2.6.2 透析。將鹽析溶液加入透析袋中，流水透析48 h，3 500 r/min離心取上清，測定核酸酶活力。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對綠豆核酸酶提取效果的影響。

由圖1可知，在提取20 h之前，隨著提取時間的延長，提取液中綠豆核酸酶酶活不斷提高；在提取20 h時達到最大值，酶活為293.76 U/mL；在20 h之后繼續延長提取時間，提取液中的綠豆核酸酶酶活逐漸下降。原因為提取20 h之前是豆芽中的綠豆核酸酶不斷被提取到提取液中的過程，提取液中酶濃度不斷增高使酶活增高；在提取20 h時綠豆芽中絕大多數的綠豆核酸酶被提取出來；再延長提取時間導致綠豆核酸酶在提取環境下存留時間過長引起部分酶活降低或者失活。

2.1.2 料液比對綠豆核酸酶提取效果的影響。

由圖2可知，在料液比1∶2～1∶8（g∶mL）時酶活力變化不明顯，1∶8～1∶12（g∶mL）時有明顯增長，1∶12～1∶16（g∶mL）時有小幅下降，其中在料液比為1∶12（g∶mL）時達到最大值，酶活為281.34 U/mL。原因為過大的料液比會稀釋酶的濃度，使單位體積提取液中酶活降低；而過低的料液比會導致綠豆核酸酶從綠豆芽中提取到緩沖溶液的速度緩慢。

2.1.3 pH對綠豆核酸酶提取的影響。由圖3可知，在其他提取條件相同時，用pH 4.0的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液提取時，酶活達到最大值，為273.42 U/ mL；酸度過高時酶活有一定幅度的下降，當pH大于4.0時酶活有明顯下降。說明過酸和過堿的提取環境都會造成酶活力的下降。

2.1.4 芽長對綠豆核酸酶提取的影響。

由圖 4可知，綠豆芽長為綠豆5倍長時酶活力達到最大值，為293.40 U/mL；當綠豆芽長小于綠豆5倍長時，隨著長度的增加酶活逐漸增加；在綠豆芽長大于綠豆5倍芽長時，隨著芽長的增加酶活逐漸降低。

2.2 正交試驗

綠豆核酸酶提取的正交試驗因素水平設計見表1，結果見表2。正交試驗結果顯示，影響綠豆核酸酶提取因素的主次順序依次為提取時間、pH、料液比、芽長，由k值分析得出的最優組合為A3B3C2D2，由表2的直觀分析得出最優組合為A3B3C1D2。綜合考慮，選取A3B3C1D2為最優組合，即提取時間20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽長為綠豆長的4倍，此條件下綠豆核酸酶酶活為478.86 U/ mL。

2.3 綠豆核酸酶粗酶的提純

由圖5可知，在硫酸銨飽和度為80%時提純效果最好，酶活為1 569.6 U/mL ，酶活力較提純前提高了2.28倍。

3 結論

該試驗以綠豆為材料，以綠豆核酸酶酶活為考察指標，在以提取時間為單因素的試驗中提取時間為20 h時，酶活最高為293.76 U/mL；在以料液比為單因素的試驗中料液比為1∶12（g∶mL）時，酶活最高為281.34 U/mL；在以pH為單因素的試驗中pH 4.0時，酶活最高為273.42 U/mL；在以芽長為單因素的試驗中芽長為綠豆的5倍長時，酶活最高為293.40 U/mL。通過正交試驗結果分析得出最佳提取條件為提取時間20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽長為綠豆的4倍長，在最佳條件下得綠豆核酸酶粗酶液的酶活為478.86 U/mL。

在硫酸銨分級沉淀試驗中，采用飽和度為80%的硫酸銨提純效果最好。綠豆核酸酶酶活為1 569.6 U/mL ，酶活力較提純前提高了2.28倍。

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