酶的定向進化及其應用進展

許勇

摘要 酶的定向進化是用于改良酶特性的一種策略，主要包括構建酶突變文庫和高通量篩選。目前，突變文庫的構建手段主要有隨機突變、半理性設計和DNA改組；高通量篩選方法主要分為體內篩選和體外篩選。該文介紹易錯PCR、半理性設計、DNA改組、表面展示、核糖體展示和差示熒光掃描等相關技術及其應用情況。

關鍵詞 定向進化；易錯PCR；DNA改組；高通量篩選

中圖分類號 Q814 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0012-03

Abstract Direct evolution of enzyme， a strategy to improve the characteristic of enzyme， mainly included constructing enzyme mutagenesis library and highthroughput screening. At present， the main methods of constructing enzyme mutagenesis library were random mutation， semirational design and DNA shuffling；highthroughput screening can be divided into in vivo screening and in vitro screening. In this study， the related techniques and their application situation， including errorprone PCR，semirational design， DNA shuffling， surface display， ribosome display and differential scanning fluorimetry， were introduced.

Key words Direct evolution；Errorprone PCR；DNA shuffling；Highthroughput screening

酶是生物體內一種重要的催化劑，目前已發現的大多數酶的化學本質為蛋白質。由于酶在體外溫和水條件下依然具有較強的催化活性，其在醫藥、農業、食品、化工、環境保護等領域得到廣泛使用[1]。酶在實踐中得到了廣泛應用，但同時具有不穩定、底物單一、反應條件苛刻等缺陷，而這些主要決定于其結構和動力學等因素影響[2]。如北美螢火蟲熒光素酶，其最適反應溫度為23 ℃，最適反應pH 為7.8[3]，這不利于其長期保存與運輸，大大限制了熒光素酶在微生物快速檢測領域的應用[4]。定向進化是達爾文選擇進化過程在分子水平的再現，主要通過巧妙的技術手段建立蛋白質的突變庫，并從中篩選出具備改良特性的蛋白質[5]。

1 酶突變文庫的構建手段

突變文庫的構建手段主要有隨機突變、半理性設計和DNA改組3類。

1.1 隨機突變

隨機突變是通過技術手段誘導目的基因發生堿基缺失、增添、替換等突變的方法構建突變文庫。易錯PCR是目前最常用的目的基因隨機突變技術。易錯PCR是通過利用低保真度TaqDNA 聚合酶和改變PCR 反應條件，如加入Mn、改變循環次數和dNTP濃度等，降低DNA 復制的保真度，在新DNA 鏈合成過程中增加堿基錯配，從而使擴增產物出現較多點突變的一種體外誘導DNA 序列變異的方法[6]。劉韓等[7]利用易錯PCR 技術向羧酸酯酶基因中隨機引入突變，建立酶基因突變文庫，篩選出的突變菌株65產生的酶在90 ℃的半衰期提高1.2 h。Mikhail等[8]經過4輪易錯PCR獲得了突變酶4TS在37 ℃時的半衰期提高了158倍，但是隨著溫度升高這種差距明顯縮小[8]。通過調整離子濃度或循環次數可以控制突變率，為防止對酶活造成破壞以及突變文庫過大難以篩選，突變率不宜太高（改變1～5個堿基或1～3個氨基酸）[5]。

理論上說，隨機突變應當是目的蛋白質的所有氨基酸位點都有同樣可能被替換為其他19種氨基酸。但實際上，由于遺傳密碼的簡并性、中性突變以及相鄰堿基同時突變概率較低等原因，易錯PCR很難做到理想化的隨機突變。飽和誘變可以將蛋白質中任意位點的氨基酸誘變為其他19種氨基酸，構建突變文庫。Wong等[9]于2004年首次提出序列飽和突變法（SeSaM），這是一種針對單鏈DNA進行突變的新技術，基本原理是在PCR擴增中，在正常dNTP中混入易被水解的α‐硫代核苷酸，得到長度不同的DNA片段庫，再利用DNA末端轉移酶在片段的3-末端引入通用次黃嘌呤核苷酸，最后通過片段延長、正常堿基替換構建目的基因突變文庫。該法可以實現目的基因任意位點的隨機突變，但在試驗過程使用了多種堿基類似物和生物素化引物，并且操作過程繁瑣耗時（一次完整試驗需2～3 d）[1，9]。2008年，Wong等[10]在原有序列飽和突變法基礎上，通過dNTP αS 、dPTP、dKTP 和 dITP等控制突變傾向，設計出了高顛換型序列飽和突變法（SeSaM-Tv+）。Acevedo等[11]利用易錯PCR和飽和誘變聯用的方式將一種冷活性木聚酶的T5015提高了4.3 ℃。

1.2 半理性設計

隨機突變雖然效果不錯，但依然存在突變文庫較大、有益突變率低、篩選壓力大等缺點。半理性設計是首先通過對蛋白結構信息進行分析確定影響特性的關鍵位點或區域，而后利用隨機突變或定點飽和突變的手段改造這一關鍵位點或區域，從而獲得有益突變株[12]。

Wang等[13]首先在野生型熱穩定性醛酮還原酶Tm1743催化機制的基礎上，通過分子模擬手段建立其與NADPH、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的結合模型，確定影響其對映選擇性的3個關鍵位點Trp118、Trp86和Trp21，之后再對這3個位點分別進行飽和誘變發現Trp86 和 Trp21 2個位點突變體的對映選擇性變化較大，并最終篩選出產（R）-和（S）-EHPB的最優雙位點突變體W21S/W86E 和 W21L/W118H，其對映體過量值（ee value）分別為99.4% and 99.6%。

Reetz等設計的迭代飽和突變（Iterative saturation mutagenesis，ISM），依據待提高的酶學活性，選擇關鍵的突變點或區域，進行反復飽和突變，最終篩選出目的突變株[1]。鈕成拓[14]根據分子動力學模擬和定點突變結果，采用迭代飽和突變對芽孢桿菌屬來源 β-葡聚糖酶中 40 位、43 位、46 位和 205 位氨基酸進行改造，通過四輪定點飽和突變，構建了7個飽和突變體文庫，從中篩選得到突變體 VII（E46P/S43E/H205P/S40E），其在 70 ℃處理 1 h 后仍能保持 59.4%的剩余酶活，是野生酶經過相同處理剩余酶活的 9.43 倍。

Reetz等[15]于2005年提出的組合活性中心飽和試驗（combinatorial active-site saturation test，CAST）包括2個步驟：一是在酶的活性中心部位尋找一系列在空間位置上相互接近的并且在側鏈基團取向上具有潛在的構象協同作用的2個氨基酸對作為突變位點。如果選擇的氨基酸對應的位置是n，則第2個氨基酸與其空間關系上遵循以下的原則：如果第n個氨基酸在環上，則另一個氨基酸選擇第n+1位；若在β 折疊上，則選擇第n+2位，若在310螺旋上，則選擇第n+3位；若在α螺旋上，則選擇第n+4位。對選取的一對氨基酸進行飽和隨機突變，即這一對氨基酸要突變成20種氨基酸的任何一種。以NNK（N代表任何一種核苷酸，K代表是G或T）作為突變的堿基形式，則有（4×4×2）.2 =1 024種不同的組合，而氨基酸則可突變成20.2 =400種不同的組合。該法在特定位點上綜合了理性設計和氨基酸組合隨機突變的特點，產生相對較小的突變文庫，減輕了篩選壓力[15]。Maddock等[16]以甘油脫水酶KpGDHt的α和β亞基融合結構為對象，應用CAST突變和保守引導突變聯用的方法，從5 500多個突變體中篩選出目標突變體T200S。

1.3 DNA改組

DNA改組是通過同源重組或非同源重組實現基因片段的交換重排，構建嵌合后代文庫。利用不同親本基因之間的重排將不同酶或突變酶的優良特性進行整合，獲得在某一特性上的再優化或多種優良特性組合的突變酶，是一種有性改組。該法可以使多基因的有益突變進行整合構建有益突變率較高的突變庫，減小了篩選壓力。根據序列特點，可以分為同源依賴型和非同源依賴型。

同源依賴型DNA改組是將具有同源區段的多個親本基因用DNase I處理成許多短小片段，再通過無引物PCR將片段延伸至完整基因長度，該法利用同源區段在退火過程中的互補結合。來自同一基因家族的基因一般都具有同源區段，以相同基因家族的不同基因（一般要求同源度>60%）為親本基因進行DNA改組是常用的方法[5]。Rigouin等[17]在易錯PCR 和CAST突變技術都失敗的情況下，以相同基因家族的hASNase1基因和gpASNase1基因（同源度：75%）作為親本基因進行DNA改組并篩選出4種Km較低的突變體，氨基酸序列分析發現重組主要發生在N-末端結構域（即催化結構域），其中有一種突變體是在催化結構域之前引入終止密碼子。

易錯PCR 多用于高頻率誘變單個基因，與DNA改組技術聯合應用可以集二者的優點，這樣不僅可以對單一基因進行易錯PCR 隨機誘變，創造新的基因，還可以將易錯PCR 獲得的有益基因改組，進行序列間的重新編排，從而獲得不同種、屬基因家族里基因序列變異為更廣、功能更強的基因。一般做法是先用易錯PCR 引入點突變，構建起始基因文庫，篩選出所有良性克隆，再以此作為親本基因進行DNA 改組，使得有益突變迅速積累，基因功能明顯提高。而且這樣所建的突變體庫小，定向進化效果顯著。也可以進行多輪改組，得到更好的結果[18]。Luo等[19]利用易錯PCR和DNA改組聯用的方法對磷酸三酯酶進行定向進化，獲得的最優突變酶活性提高了25倍，T5015達到67.6。張凱[20]通過1輪易錯PCR和2種DNA改組方法聯用，經過兩輪高通量篩選，最終得到酶活提高2倍的突變株。因此，易錯PCR 與DNA改組聯合應用逐漸成為基因誘變的主要方法之一。

2 高通量篩選方法

定向進化手段改造編碼酶的基因必然會有數量龐大的突變庫，通過合適的篩選系統快速地從突變體文庫中篩選出符合目標的蛋白質成為關鍵[21]。目前，采用的高通量篩選方法主要可以分為體內篩選和體外篩選2種類型[5]。體內篩選方法依賴完整的細胞結構，具有代表性的是表面展示技術，而體外篩選方法則是于胞外完成（也可利用細胞組成成分），主要包括核糖體展示技術、差示熒光掃描等。

2.1 表面展示技術

表面展示技術，是運用基因工程手段將目的基因到宿主基因組中，是目的蛋白表達并展示于宿主表面，通過親和篩選開展綜合性功能鑒定。目前常用的表面展示技術有噬菌體表面展示技術和酵母細胞表面展示技術。

2.2 核糖體展示技術

核糖體展示技術的本質是利用形成的mRNA-核糖體-蛋白質三聚體復合物，通過核糖體把新生蛋白和其mRNA 聯系起來，通過刪除PCR 片段的終止密碼子產生真核PRM 復合物，產生的PRM 復合物隨后通過抗原包被的磁珠進行捕獲，mRNA 通過RT-PCR 無需解離核糖體復合物就可得到相應的DNA[22]。Skirgaila等[23]運用體外區劃技術（in vitro compartmentalization，IVC）對核糖體展示技術進行改進，提出了區劃核糖體展示技術（compartmentalized ribosome display，CRD）。研究者們以油包水乳液的方式對單個三聚體復合物進行區劃，實現單酶分子水平的篩選，最終篩選的突變型的M-MuLV反轉錄酶在53～58 ℃依然可以催化合成完整長度的cDNA片段（野生型酶在48 ℃以上即無法完成）。

2.3 差示熒光掃描（differential scanning fluorimetry，DSF）

差示熒光掃描作為一種分析蛋白質熱穩定性的分析手段，其方法簡單，效率高。其原理是通過對樣品進行緩慢地加熱，在加熱的過程中，檢測熒光物質與結構發生改變的蛋白相結合的量，來研究蛋白質的熱穩定性。朱磊[24]利用DSF法發現經過酶切破壞糖基化修飾以后，在更低的溫度下就能使CTLA4.Ig的結構發生改變。DSF可以幫助評估突變蛋白的結構熱穩定性，如果活性熱穩定性好的蛋白，結構熱穩定也好，則可以推測這種突變是通過穩定結構來提高酶的熱穩定性的。

3 結論與展望

定向進化是一項體外改造酶的較為成熟的技術，已被成功用于改造酶的活性、熱穩定性，底物專一性和對映選擇性等[5]。構建突變文庫和高通量篩選是酶定向進化不可或缺的組成部分。在構建突變文庫方面還存在對突變率和突變位點的控制不足的問題，堿基偏愛性的問題依然存在，因此探索可控性更強的突變文庫構建方法將是研究熱點。高通量篩選方面，目前并沒有一種通用的篩選方法適用于所有的改組蛋白，所以需要設計針對目的改造特征的篩選方法。要想將基因與酶的產物之間建立起直接的聯系依然需要針對不同酶、不同反應和不同底物進行設計[25]。熒光激活細胞分選技術（fluorescence-activated cell sorting，FACS）近年來發展迅速，具有快速和高通量的特點，是最具潛力的高通量篩選手段之一。

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