黔南州茶園土壤中優(yōu)勢菌株煙曲霉的分離·純化及鑒定

周小露 宋麗莎 王利榮

摘要[目的]分離一株適于開發(fā)茶園專用有機肥的菌株。[方法]以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，進行微生物分離、純化、形態(tài)鑒定及分子鑒定。[結(jié)果]通過優(yōu)質(zhì)土壤的分離、純化得到優(yōu)勢菌株S2；該菌株邊緣薄，中心有不規(guī)則狀的條紋，表面呈絨毛狀，灰白色，背面淡青色；提取菌株S2 DNA，進行凝膠電泳及PCR擴增，經(jīng)BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，病原真菌的rDNA-ITS序列與Aspergillus fumigatus（JQ268555.1）的序列相似度高達100%。[結(jié)論]結(jié)合形態(tài)學與分子生物學鑒定，確定從茶園土壤中分離、純化得到的菌株為煙曲霉菌。

關(guān)鍵詞 煙曲霉；菌體形態(tài)；形態(tài)鑒定；分子鑒定

中圖分類號 S154.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0115-04

Abstract[Objective]To isolate a strain suitable for the development of organic fertilizers for tea gardens.[Method]The highquality soil of tea gardens in Qiannan Prefecture was used as the material for microbial isolation，purification，morphological identification and molecular identification.[Result]The superior strain S2 was obtained through the separation and purification of highquality soil.The strain had a thin edge，irregular stripes at the center，and the surface was villous，grayish white and light blue on the back；the strain S2 DNA was extracted and subjected to gel electrophoresis and PCR amplification.After BLAST comparison，the sequence similarity of the rDNAITS sequence of pathogenic fungi to Aspergillus fumigatus （JQ268555.1） was as high as 100%.[Conclusion]According to the morphological and molecular biological identification，the strain isolated and purified from the tea garden soil was identified as Aspergillus fumigatus.

Key words Aspergillus fumigatus；Cell morphology；Morphological identification；Molecular identification

在貴州農(nóng)業(yè)中，茶葉占重要經(jīng)濟地位，截至2018年茶園面積達46萬～67萬hm2；其中黔南州種植面積為10萬hm2，占貴州省茶園總面積的21%，是重要茶區(qū)之一。黔南州《關(guān)于進一步加快推進茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見》明確提出有機茶的發(fā)展目標，在有機茶園建設(shè)過程中，必須提高無害化有機肥的投入，構(gòu)建茶園動態(tài)植保體系。然而大量使用化學肥料會帶來土壤酸化、重金屬超標、農(nóng)藥殘留等問題。

研究表明，貴州茶區(qū)如都勻茶區(qū)[1-2]pH為3.00～4.00；湄潭和鳳岡pH為4.00～4.50；正安pH為4.00～5.00，土壤大面積酸化。茶樹缺少大量元素，植株矮小，產(chǎn)量降低。目前，可用于茶樹的生物有機肥較少，但使用化肥已對茶園造成嚴重危害，研制可供茶樹使用的生物有機肥迫在眉睫。

秸稈內(nèi)含有大量有機物，不僅可以增加土壤有機質(zhì)含量，補充大量元素，而且是最常見的生物有機肥原料之一。生物有機肥的制造過程需大量使用秸稈，不僅可以使秸稈重歸田間，而且通過對秸稈的回收，有效避免了秸稈燃燒造成的大氣污染。

生物有機肥制作大多采用秸稈、微生物、腐殖質(zhì)等天然原料，具有無毒、無害、成本低、見效好等優(yōu)點，有機肥有效地利用天然原料，循環(huán)利用，變廢為寶。使用生物有機肥不僅不會造成土壤環(huán)境的危害，利用微生物還可以大大改善因大量使用化肥而造成的土壤酸化、重金屬超標等問題。

生物有機肥中有效菌種發(fā)酵產(chǎn)生的多種可溶性生理活性物質(zhì)，如有機酸、維生素等能被植物迅速吸收。施用有機肥[3-7]可降低土壤的酸化程度，有利于加快土壤中氮、磷等元素循環(huán)[8-11]，有助于緩解土壤酸化趨勢[12-14]，減少Cd等[15]重金屬的累積；促進茶樹提早萌發(fā)[16]，茶葉長勢良好，芽葉密度大，芽質(zhì)量明顯提高，增加了茶鮮葉中茶多酚、咖啡堿、水浸出物、可溶性糖的含量，茶葉氟含量明顯下降。

土壤是植物吸收養(yǎng)分的主要來源之一，通過給茶樹施肥能改良茶樹因缺少大量元素造成的葉片發(fā)黃等問題。茶樹專用有機肥既可做基肥也可做追肥，速效與緩效養(yǎng)分協(xié)調(diào)，肥料利用率高，可減輕氮肥造成的硝酸鹽積累以及磷鉀肥造成的重金屬污染，因此都勻毛尖茶區(qū)專用有機肥的研制迫在眉睫。筆者以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，分離、純化得到優(yōu)勢菌株，通過形態(tài)鑒定和分子鑒定，明確優(yōu)勢菌株的背景，以期為其茶園專用有機肥的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土樣：采集于都勻三江堰茶園；蔗糖：化學純，天津市密歐化學試劑有限公司；瓊脂粉：北京鼎國昌盛生物技術(shù)責任有限公司；

磷酸二氫鉀：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；葡萄糖：分析純，天津市化學試劑公司；氯化鉀：分析純，汕頭市光華化學廠；硫酸鎂：分析純，重慶茂業(yè)化學試劑有限公司；其他材料：硝酸鈉，乙醇，氯霉素，硫酸鐵，蒸餾水，馬鈴薯，KAC，異丙醇，溴酚藍，液氮。

1.2 試驗儀器

電子顯微鏡：XSP-8C，德卡精密量儀（深圳）有限公司；超凈工作臺：SW-CJ1FDA，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：GI54DS，致微（廈門）儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：BIC-250，上海博迅實業(yè)有限公司；冰箱：BCD-251WBSV，上海帝覽實業(yè)有限公司；電子天平：LTI000B，常熟市天量儀器有限責任公司；其他儀器：保鮮膜，濾紙，酒精燈，取樣袋，蓋玻片，載玻片，玻璃棒，燒杯，紗布，量筒，鑷子，接種環(huán)，涂布棒，記號筆，鏟子，藥匙，報紙，橡皮筋，培養(yǎng)皿，試管，三角瓶，一次性手套，標簽紙。

1.3 試驗方法

1.3.1 預(yù)處理。為了減少土壤樣品中的雜物，防止其他物質(zhì)菌體的干擾，用滅菌過后的菌鑷子夾出草、石頭等物質(zhì)，再把處理好的土壤放入-5 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 培養(yǎng)基配制。

①PDA：洋芋200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。②PSA：洋芋200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。③WA：瓊脂粉13 g，蒸餾水1 000 mL。④察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，七水合硫酸鎂0.5 g，硝酸鈉2 g，氯化鉀0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3.3 菌株分離。①取土樣。在都勻三江堰茶園中，挑選優(yōu)質(zhì)土壤，用鏟子挖出，裝入密封袋中，用標簽紙貼好并編號，帶入實驗室以便制作菌種懸液。

②材料消毒。防止帶回土壤被周圍環(huán)境中的菌種污染，試驗操作要求在無菌條件下進行。提前2 h將制備的培養(yǎng)基、試驗所用工具和蒸餾水（制備稀釋濃度梯度的無菌水）放入高壓滅菌鍋中滅菌，以使用。③土樣稀釋。取20 g土壤放入三角瓶中，裝入80 mL無菌水，搖晃20 min，制備菌種原懸液；再依次稀釋得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度的菌種懸液（圖1）。④涂布接種。在酒精燈周圍，用接種環(huán)蘸取1～2滴菌種懸浮液，使用涂布法在已制備的培養(yǎng)基中接種，并將接種濃度用標簽紙在培養(yǎng)皿上記錄。試驗完成后，整理并關(guān)閉超凈工作臺，把已接種的培養(yǎng)基放入25 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6～7 d。直至有菌落形成時，即可對菌株進行純化。

1.3.4 菌株純化。

①準備。培養(yǎng)至第6天，在培養(yǎng)基上可明顯觀察到菌落。挑選培養(yǎng)基上生長旺盛的菌落，使用涂布平板劃線法進一步純化處理。

②接種。首先在培養(yǎng)皿底部用記號筆畫出等邊的頂點3個點，并標號。落點時注意在酒精燈周圍操作，先把接種環(huán)在酒精燈上灼燒2～3 s，待接種環(huán)溫度降低，即可把接種環(huán)放入培養(yǎng)基中降溫，防止較高溫度殺死菌種。用接種環(huán)沾取菌，從標記的第1個點開始落點后，繼續(xù)朝第2個點，接著再朝第3個區(qū)域點，以此類推。

③培養(yǎng)。將接種優(yōu)勢菌的PDA培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)3～5 d。經(jīng)培養(yǎng)后，每個皿形成3個菌落。

④觀察。待優(yōu)勢菌長出菌落后，觀察優(yōu)勢菌長勢是否良好，如果有雜菌需要再進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

1.3.5 菌株鑒定。

1.3.5.1 形態(tài)學鑒定。

①鏡檢鑒定。在察氏或PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，待菌株產(chǎn)生孢子結(jié)構(gòu)時，在菌落邊緣和中間挑取少許菌落，制成標本，并固定好，利用電子顯微鏡在40倍和100倍顯微鏡下對菌種進行觀察，并記錄菌種的相關(guān)特征，根據(jù)菌落的形狀、大小、顏色、表面特征來鑒定，初步判斷該菌種的種類。

②生長速率的測定。在無菌環(huán)境下，把優(yōu)勢菌株打成直徑5 mm的菌餅，轉(zhuǎn)移至25 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d后，量取優(yōu)勢菌餅直徑的大小，比較其變化，即可計算優(yōu)勢菌的生長速率，并記錄優(yōu)勢菌的生長特征。

1.3.5.2 分子鑒定。

（1）DNA的提取。①研磨菌絲，加入500 μL 裂解液，放置10 min；②加入濃度3 mol/L的KAC 150 μ L，12 000 r/min 離心15 min，取其上清；③重復(fù)②，取上清液并加入異丙醇，在12 000 r/min 下離心15 min；④取其上清，加300 μL 70%乙醇沉淀DNA，在12 000 r/min下離心10 min，洗滌2～3次；⑤等待水分散失，加0.1×TE 30 μL，最終獲得液體狀態(tài)下的DNA。

（2）PCR擴增。以ITS2的5′- TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′作為引物（5′- TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′，由華大基因生物技術(shù)有限公司合成），擴增體系總體積為25.000 μL（DNA模板1.000 μL、10× buffer緩沖液體2.500 μL、dNTPs 2.000 μL、正向引物1.000 μL、反向引物1.000 μL、Ex Taq DNA聚合酶0.125 μL、ddH2O 17.400 μL），以體系中不加菌株DNA提取物作為陰性對照，進行PCR擴增，擴增完成取出產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱，備用。

（3）電泳。①制膠。稱0.2 g瓊脂糖，加20 mL 0.5 TBE緩沖液（pH 8.0），用微波爐加熱1.5 min，拿出瓊脂糖溶液，靜置一段時間后，加入1 μL Goldview指示劑，搖勻；插好梳子，穩(wěn)定模具，把凝膠倒入制膠模具。②電泳。將制膠板置于電泳槽中。取5.0 μL擴增產(chǎn)物加入2.5 μL溴酚藍，混勻后點樣。開啟設(shè)備，設(shè)定電壓（120 V）和時間（30 min）。

試驗結(jié)束后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并將PCR擴增產(chǎn)物送至華大基因生物技術(shù)有限公司（廣州部）測序。

（4）序列分析。把測序得到的序列放到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫進行Blast檢測，下載優(yōu)勢菌株的序列。將優(yōu)勢菌株的序列導(dǎo)入MEGA 6.0軟件，使用多序列比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定菌株種別。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢菌分離

以優(yōu)質(zhì)土壤（圖2）為材料，利用稀釋涂布分離得到5種菌；進一步利用3點接種法，純化該菌株，最終得到優(yōu)勢菌株S2（圖3），該菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃下培養(yǎng)4～6 d長勢旺盛，同時該菌株生長周期較長。

2.2 優(yōu)勢菌鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定。

利用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法，對“2.1”分離、純化得到的優(yōu)勢菌株S2進行觀察。利用電子顯微鏡觀察，優(yōu)勢菌種S2邊緣薄，中心有不規(guī)則狀的條紋，生長表面呈絨毛狀，灰白色或乳白色，培養(yǎng)基為淺綠色到灰白色，背面淡青色；向上突起的菌絲在球形頂囊上分生出粗糙的孢子梗，孢子梗中長出許多分生孢子，頂囊為半球狀，在1/2或1/3處有雙層小梗；分生孢子頭呈放射狀，大小為1.5～2.5 nm。小梗雙層，梗基0.5～1.0 nm，小梗1.0～1.5 nm，分生孢子球形，粗糙，直徑1.0～1.5 nm或稍大。菌落大小為4.0～8.6 nm。根據(jù)優(yōu)勢菌株S2的形態(tài)特征，初步確定該菌屬為曲霉屬真菌（圖4）。

2.2.2 分子鑒定。

提取菌株S2 DNA，進行凝膠電泳及PCR擴增得到1條946 bp的清晰條帶（圖5），將此PCR產(chǎn)物測序后提交至GenBank中，經(jīng)BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，病原真菌的rDNA-ITS序列與Aspergillus fumigatus（JQ268555.1）的序列相似度高達100%。依據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖6），表明該菌應(yīng)為Aspergillus Caesiellus。

再結(jié)合形態(tài)學與分子生物學鑒定，確定從茶遠土中分離純化出的菌為曲霉屬煙曲霉菌Aspergillus fumigatus。其屬于真菌界 Mycota真菌門 Eumycophyta半知菌亞門Deuteromycotina半知菌綱 Sphaeropsidales殼霉目 Discellaceae杯霉科 Aspergullus niveus曲霉屬 Aspergillus煙曲霉 Aspergillus fumigatus。

3 結(jié)論與討論

（1）該研究取黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，對其進行稀釋，將其樣品懸液涂布于培養(yǎng)皿培養(yǎng)得到多種菌種，并對菌種進行分離，再挑取菌種純化得到優(yōu)勢菌株S2。

為了明確優(yōu)勢菌株的背景，對優(yōu)勢菌株S2的鑒定主要采用傳統(tǒng)的生物形態(tài)學鑒定法，利用電子顯微鏡進行觀察，初步確定該優(yōu)勢菌株S2為Aspergillus曲霉屬。生物形態(tài)鑒定法鑒定品種的形態(tài)特征很有限，同時還受觀察時段的影響，并且這些性狀適用于某些品種間差異明顯的樣品鑒定，因此在實用中存在一定的局限性。

為了更好地明確優(yōu)勢菌株的背景，再采用分子鑒定法對優(yōu)勢菌株S2進行鑒定，分子鑒定法的優(yōu)點： ITS序列的保守性大體上表現(xiàn)為與其種屬相對一致，ITS的種間差異較明顯，能精確地反映種間及菌株間的堿基對差異； ITS序列的片段較小，更有利于分析真菌種屬之間的發(fā)育；ITS序列分析在很大程度上彌補形態(tài)學特征分析的很多不足。結(jié)合形態(tài)鑒定和分子鑒定可確認優(yōu)勢菌株S2為曲霉屬煙曲霉菌Aspergillus fumigatus。

（2）微生物是土壤的重要組成部分，在土壤中起著至關(guān)重要的作用，該研究煙曲霉參與茶樹特制有機肥研發(fā)，可調(diào)節(jié)肥料的養(yǎng)分，提高肥料利用率，還可減緩硝酸鹽的積累和重金屬污染。關(guān)于用曲霉屬真菌作為生物有機肥的研究很少，曲霉屬真菌對于茶樹有無益處還有待進一步研究。雖然在根系土壤中含有的大量曲霉目前尚未有相關(guān)的益、弊研究，可以確定的是相關(guān)曲霉可以改善土壤，今后可在曲霉方面進一步研究。

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