金屬硫蛋白的研究進展

李停停　宗婧婧　高學慧

摘要金屬硫蛋白（MT）是一類富含半胱氨酸、具有金屬結合特性、廣泛存在于動物、植物、微生物體內一類低分子量多功能誘導性蛋白。MT具有清除自由基、調節生物體內微量元素濃度、參與重金屬的解毒的作用，參與激素的調節、細胞代謝的調節，在細胞增殖分化控制中都有重要作用。就金屬硫蛋白的理化性質、提取純化技術、檢測技術、生物學功能等研究進展及應用前景進行綜述，以期為其開發應用提供參考依據。

關鍵詞金屬硫蛋白；理化性質；分離純化；檢測技術；應用前景

中圖分類號Q51文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0015-04

Research Progress of Metallothionein

LI Tingting1，2，ZONG Jingjing1，2，GAO Xuehui1，2 et al

（1.Zhejiang Ocean University， Zhoushan， Zhejiang 316021；2.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang， Zhoushan， Zhejiang 316021）

AbstractMetallothionein （MT） is a low molecular weight multifunctional induced protein， which is rich in cysteine， has metal binding properties， and widely distributes in animals， plants and microorganisms.MT can scavenge free radicals and plays important roles in modulating concentrations of trace elements and detoxification of heavy metals.In addition， MT is also involved in the regulation of hormonal and cell metabolism， the control of cell differentiation and proliferation.The research progress and application prospects of metallothionein physicochemical properties， extraction and purification techniques， detection techniques， biological functions were reviewed to provide reference for its development and application.

Key wordsMetallothionein；Physicochemical properties；Extraction and purification；Detection techniques；Application prospect

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類廣泛存在于生物中的低分子質量（6～7 kD）、無芳香族氨基酸、富含金屬與半胱氨酸（Cys 20%～30%）的獨特生物學特性的金屬結合蛋白[1]。1957年，美國科學家Margoshes和Vallee最早從馬腎中分離得到金屬硫蛋白，繼1975年Prinz從釀酒酵母中分離得到Cu-MT后，1977年科學家又從大豆的根中分離出富含Cd2+的類金屬硫蛋白[2-3]。金屬硫蛋白中大量巰基賦予了其螯合重金屬離子功能及重金屬解毒作用，同時MT清除自由基的能力明顯強于超氧化物歧化酶和谷胱甘肽，并調節生物體內微量元素濃度，調節細胞代謝、增殖分化，在食品、醫藥、保健、環境、化妝品、生物工程等領域中應用廣泛[4-5]。近年來，MT由于獨特的生物學功能，逐漸受到重視并成為研究的熱點。就金屬硫蛋白的理化性質、提取純化方法、最新檢測技術、生物學功能等研究進展及應用前景進行綜述，以期為其開發應用提供參考依據。

1金屬硫蛋白的理化性質

1.1組成

金屬硫蛋白有獨特的組成和性質，先前研究發現MT進化具有高度保守性，根據金屬含量及氨基酸組成的不同可將金屬硫蛋白分為MT-I、MT-II、MT-III及MT-IV 4種亞型結構[6]。近來研究發現，不同生物體內提取出的MT分子的形狀大小相差甚小，氨基酸序列同源性相對較高。MT的相對分子量為6～7 kD，分子中含有61個氨基酸，大部分MT含有20個Cys，少數含有21個Cys，且易與重金屬離子絡合[7]。MT的高級結構主要有2個獨立的結構域組成，即含4個金屬離子結合位點的α域（羧基端）和含有3個金屬離子結合位點的β域（ 氨基端）[8-9]，整個分子呈啞鈴狀，這種結構使MT具有很好的熱穩定性。近年來，Duncan等[10]綜合利用核磁共振（ nmR）、質譜儀（MS） 技術及X射線衍射技術，發現利用Cd誘導哺乳動物金屬硫蛋白，α域能夠結合Cd2+達5個以上。

1.2等電點

電泳的方法可以確定蛋白質的等電點，金屬硫蛋白等電點pI一般在4左右，低pH值下較穩定。哺乳動物MT的pI范圍在3.9～4.6，現有的水生生物MT的pI通常在3.5～6.0范圍內[11]。蛋白質在等電點時，因為沒有相同電荷而互相排斥的影響，溶解度最小，極易沉淀析出，因此可以根據蛋白質帶電性質的差異、形狀大小的不同通過電泳的方法分離純化金屬硫蛋白。

1.3可誘導性

金屬硫蛋白作為一種應激蛋白，具有顯著的可誘導性，可以采用物理或者化學方法對生物體進行誘導產生MT。最常用的方法是重金屬誘導，許多金屬例如Hg、Ag、Cu、Cd、Zn等都能誘導MT的合成[12]。一些激素如糖皮質激素、腎上腺激素、胰高血糖素和環磷酸腺苷（cAMP）等通過增加肝臟MT-mRNA的水平誘導MT的合成。日常生活中，生物體會在各種外在刺激條件下引起MT合成增加，從而防衛保護機體[13]。安建平等[12]通過不同濃度Cd2+誘導黃瓜產生金屬硫蛋白，1 000 mg/L Cd2+誘導黃瓜幼葉組織產生金屬硫蛋白的產量最高，可達2.62 μg/g。目前，大多數學者采用重金屬誘導MT合成，但是重金屬對生物體有害，且較難去除。郭祥學等[13]用Zn誘導藍藻提取分離出類金屬硫蛋白組分，為金屬硫蛋白功能深入研究提供新的途徑。

1.4穩定性與光譜特性

MT結合金屬能力的順序為Hg2+>Ag+>Cu2+>Cd2+>Zn+，且與Cd2+或者Ag+結合后，很難被其他金屬置換[14]。在酸性條件下，MT上結合的金屬可以脫去，去金屬的硫蛋白在低pH值下較穩定。中性條件下，硫蛋白分子間發生二硫交聯，進而形成大分子聚合物，生理活性發生一些變化。因此，環境中pH的高低、MT結合金屬與否，以及結合金屬的種類直接影響MT的穩定性和存在形式 [15]。

MT的特征吸收峰與其氨基酸組成和所結合的金屬種類密切相關，一般蛋白質在280 nm處有特征吸收峰，由于MT不含芳香族氨基酸且金屬通過硫酯鍵與蛋白質結合因而具有特殊吸收光譜。MT與不同金屬結合產生的不同的特征吸收峰為： Zn-MT 225 nm，Cd-MT 250 nm， Cu-MT 275 nm，Hg-MT 300 nm，因此可以根據吸收峰的不同對MT進行分離鑒定[16-17]。金屬硫蛋白在脫掉金屬離子后，于190 nm處有一明顯的鍵吸收峰。

2金屬硫蛋白的提取和分離純化

2.1金屬硫蛋白的提取技術

關于MT的結構與功能的研究是當今化學、生物學和臨床醫學等領域的重要課題之一，隨著研究工作的不斷深入，對MT的用量和純度的要求越來越高。勻漿離心法是提取海洋生物中MT最常采用的方法，提取劑選擇性質穩定且與生理體液相容性好的Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷，簡稱 Tris）緩沖溶液。不同濃度、pH的提取液，以及樣本與緩沖液的質量體積比、勻漿液離心轉速大小，時間長短，都會對MT的提取率產生影響。因此，不同的方法，提取的 MT含量和純度等也不盡相同[18]。王俊坤[19]通過響應面優化分析，改進魚肝中 MT提取工藝，當提取劑Tris-HCl緩沖液pH在8.0～8.5，提取溫度在45～52 ℃，緩沖液的濃度為 0.25 mol/L，物料比為 1∶7，提取時間為1 h，可獲得最佳提取效果。

2.2金屬硫蛋白的分離純化技術

為深入研究金屬硫蛋白結構和功能特性及其相關性，需要對金屬硫蛋白提取液進行濃縮處理。在蛋白的純化過程中，一次性處理較多樣品時，可以采用超濾法進行脫鹽濃縮，不但耗時短，濃縮的效率高，而且可降低蛋白質的損失率 [20]。

目前，金屬硫蛋白分離純化技術主要有：膜分離技術、高效液相色譜[21]、凝膠過濾色譜、離子交換色譜[22]、毛細管電泳法[23]等。最常用的方法是凝膠過濾和離子交換技術相結合方法。凝膠過濾法的缺點是不能將 MT 的亞型分開，所以一般采用高效液相色譜法（HPLC）對MT進行微量分離。高效液相色譜具有分離效果顯著、精密度與靈敏度佳、重現性好等優點，對于復雜成分的分離鑒定更有應用價值。ICP-MS技術干擾較少，精密度高，分析速度快，檢出限較低，動態線性范圍寬，并且可提供準確的同位素信息。高效液相色譜法（HPLC）與質譜儀（ICP-MS）聯用，不僅可以將微量MT分離，還能將MT亞型較好地分離，從而獲得較高純度的金屬硫蛋白[24]。

3金屬硫蛋白的檢測技術

基于金屬硫蛋白的理化特性、生物特性以及免疫學特性，主要檢測方法有：金屬親和層析、疏基檢測（電化學法和分光光度法）、蛋白質檢測（免疫法和色譜法）。兔肝Zn-MT是常用的MT標準品。

3.1金屬親和層析法

金屬親和層析法（金屬飽和法）主要是根據MT熱穩定性和對不同金屬的親和力的差異性建立，間接測定MT中金屬含量的增加量，從而計算出MT的含量。該法迅速而簡單，是測定MT最普遍使用較成熟的方法，但是金屬除與MT結合外，可能會結合其他干擾性的小分子化合物，使測定結果不夠準確[25]，如汞飽和法中Hg+除了與MTs結合，也會結合其他小分子量化合物。

3.2電化學法

電化學法原理是根據巰基（-SH）在汞滴電極表面產生的氧化還原反應引起電位變化建立的，通過測定巰基含量間接定量金屬硫蛋白含量。它打破了金屬飽和法的限制，具有特異性好、靈敏度高等優點。目前，主要測定方法有示差脈沖伏安法（DPV）[25]、示差脈沖極普法（DPP）、陽極溶出伏安法（ASV）等[26]。Oliveria等[27]采用示差脈沖極普法測定歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla L）不同部位的金屬硫蛋白含量，回收率范圍在 97%～103%，準確度較高。電化學法的缺點是對待測樣品純度要求較高，當樣品的含量較低時靈敏度差，其他含巰基官能團的蛋白質化合物存在會影響分析結果[28-29]。

3.3分光光度法

分光光度法是根據巰基與5，5-二硫硝基苯甲酸（DTNB） 反應產生的一種黃色物質硫代硝基苯甲酸陰離子（TNBA），TNBA在波長412 nm處具有強吸峰。該方法對低含量MT靈敏度較差，Viarengo 等[30]在傳統方法的基礎上進行改進，將2 mol/L NaCl加入DTNB試劑中，2 mol/L NaCl可使 MT 結構改變暴露-SH，有利于樣本與 DTNB 反應。

3.4免疫分析法

金屬硫蛋白分子量較低，利用其免疫特異性制成抗體單體來檢測金屬硫蛋白的含量。免疫法適用于微量檢測，最大優點是靈敏度高、特異性好，靈敏度在pg/mL級，對于金屬硫蛋白含量低的樣品仍具有較好的檢測結果。近年來，學者們先后建立蛋白質印跡分析法、放射性免疫監測法和酶聯免疫吸附法 [31]。免疫分析法缺點：不能實現蛋白同分異構體的定量分析，并且需要高特異性抗體來源，由于抗體比較難制備等原因影響該法發展。

3.5色譜分析法

一般蛋白質在280 nm處有特征吸收峰，而金屬硫蛋白通過硫酯鍵與蛋白質結合具有特殊吸收光譜，通過圓二色譜法（CD）或磁圓二色譜（MCD） 測量其在 220～350 nm的吸光度進而定性定量MT。在分析不同亞型的MT時，學者一般采用HPLC分離技術與AAS、MS、FD等檢測器聯用，通過MT標準樣品進行對照，確定待測樣品MT的濃度，靈敏度低于1 μg/mL。Park等[32]運用RP-HPLC-FD方法測定狼鱸（Dicentrarchus labrax）肝組織中MT總量，測定結果相比分光光度法高出1.30～1.95倍，更準確地反映肝組織MT含量。

4金屬硫蛋白的生物學功能研究現狀

4.1解除或降低重金屬的毒害作用

重金屬元素具有蓄積毒性，當重金屬在機體蓄積達到一定量后，會導致重金屬中毒。研究表明，當機體出現重金屬急性中毒后，會出現惡心、嘔吐等癥狀。機體長期處于重金屬的環境，心血管系統、神經系統和免疫系統等會受到嚴重傷害。金屬硫蛋白中大量巰基賦予其螯合重金屬離子功能，進而解除重金屬對大腦、肝、腎等重要器官的損傷。有關MT 對重金屬的解毒作用的報道已經有很多。張敬旭等[33]研究表明，鉛引起的腦組織脂質過氧化反應的增強與MT的缺失有關，并引發鉛的神經發育毒性。MT結合金屬能力的順序為Hg2+>Ag+>Cu2+>Cd2+>Zn+，且MT與Cd2+或者Ag+螯合后，其他金屬將很難置換Cd2+和Ag+ [34]。MT具有抗酶解的優點，能夠被人體完整吸收。MT不但對重金屬元素有抑制和解毒的作用，在基本元素的調節中也起重要作用，是目前臨床上最理想的生物螯合解毒劑[35]。

4.2清除自由基和抗氧化作用

機體在新陳代謝過程中會產生一些具有強氧化性的化合物，如羥基自由基、氧自由基等，這些自由基會損害機體的組織和細胞，進而引發健康問題，并出現衰老等生理現象。MT中的巰基能保護細胞器及其他重要的生化物質，如酶類、DNA 等免受自由基的侵害 [34]。MT清除自由基能力較強，清除氧自由基的能力是谷胱甘肽的25倍，清除羥基自由基的能力是超氧化物歧化酶的10 000倍[36]。Akashi等[37]和Wong等[38]研究發現，大米和西瓜中的重組 MT可以有效地清除巰基自由基。

金屬硫蛋白是體內最佳的抗氧化調節劑，抗氧化特性一直備受科學家的關注。MT可以通過結合或釋放金屬離子來調節自由基的水平，對由于金屬離子調節機制穩態失衡對機體造成的氧化損傷起到一定預防和修復作用[39]。MT易被多種機制誘導產生，防止細胞因氧化所造成的炎性浸潤，顯著提高機體的免疫調節能力及抗氧化能力。鄒學敏等[40]將MT注射到鉻中毒小鼠發現，小鼠肝組織SOD活性和丙二醛（MDA）含量能夠得到有效提高，MT還可以較好地修復鉻引起的肝臟氧化損傷，說明MT對機體具有保護和修護的雙重功效。

4.3抗腫瘤功能

癌癥是人體的頭號殺手，現代醫學迫切需求新型有效的抗癌藥物，MT 抗腫瘤的生物功能已經引起人們的關注。研究發現MT參與腫瘤細胞的分化、增生及凋亡，同時MT的重金屬解毒，抗自由基作用可保護細胞抵御致癌物質的作用。在一些腫瘤組織中，可檢測到 MT的過度表達，張燕等[41]研究發現，MT在機體中表達與腫瘤組織的分化有一定聯系，MT的表達與腫瘤組織的分化成反比，進而說明 MT 的抗腫瘤作用。MT參與腫瘤細胞的分化和增生，降低癌癥發生的概率，并能有效減輕抗腫瘤藥物毒副作用[42]。細胞受致癌物刺激后會產生一系列的保護機制來清除致癌物，MT作為一種細胞凋亡抑制劑，其水平增高可能是這些保護機制之一[43]。

4.4抗輻射

金屬硫蛋白組分具有一定的抗電離輻射的能力，各種電離輻射作用下大量的自由基會在機體產生，生物體功能將直接或間接受到損傷。研究發現，小鼠經過一次性強額度電離輻射后，可誘導小鼠肝臟 MT-mRNA 的轉錄，從而顯著延長小鼠存活時間。此外，進入生物體內的半胱氨酸能被MT大量吸收，作為二硫鍵修復原料，修復生物體內受損的細胞[44]。

5金屬硫蛋白的應用現狀

5.1金屬硫蛋白在醫學上的應用

金屬硫蛋白的抗病作用已經被多次證明，在治療癌癥、血管疾病、重金屬中毒及營養缺乏癥等方面功效顯著[45]。金屬硫蛋白參與癌癥細胞的增殖、分化、凋亡等過程，在腫瘤預防和治療中，MT的重金屬解毒、清除自由基功能可抵御重金屬和烷化劑對細胞的致癌、致突變作用。MT與某些癌癥細胞的增殖活性密切相關，因此可作為腫瘤治療的潛在靶標，并且能有效減輕放射療法的副作用，保護正常細胞在放療過程中免受侵害。金屬硫蛋白不僅在腫瘤細胞中表達異常，而且能抑制其他重大疾病的發生與發展。研究表明，金屬硫蛋白具有抑制胃潰瘍的形成、阻止脂質過氧化、增強吞噬細胞、抵抗輻射和光損傷、提高免疫力、促進細胞新陳代謝等功能特性[46]。

5.2金屬硫蛋白在化妝美容品中的應用

MT 可作為化妝品的添加劑，安全性能好，具有抗衰老、清除色素、減輕皺紋、防治皮炎的作用，消除化學型化妝品對人體的毒副作用。MT與 SOD 相比具有分子量小、易被機體吸收、清除羥自由基能力強、熱穩定性高、半衰期長等優點，且MT還可以拮抗紫外線、輻射等。由于 MT 為生物制劑，且為人體所固有，因此可用于美容護膚。

5.3金屬硫蛋白對重金屬中毒的檢測和環境監測

由于 MT廣泛存在動物、植物、微生物中，且可與重金屬結合的性質，不僅可以用于監測海洋環境重金屬污染狀況，也可作為衡量環境重金屬污染狀況的一個生物指標，除此之外，還可用于重金屬的回收和清除環境中的重金屬污染等方面。MT也將有望通過基因工程技術來治理重金屬污染，如通過植物自身MT的表達或外源基因導入來實現治理土壤的重金屬污染，另一方面通過水生生物富集作用減少水體中的重金屬含量，從而維持生態系統穩定。Baudrimont 等[47]通過監測牡蠣鰓中MT含量衡量海域中重金屬的污染狀況；Thomas等[48]將酵母MT基因插入煙草基因序列中，發現轉基因煙草吸收污染土壤中Cu2+的能力得到顯著提高。Amiard 等[49]研究認為，貽貝體內的MT 水平與環境中釩的含量有顯著相關性，因此MT可作為海洋中釩污染的生物監測標志物。

5.4金屬硫蛋白在水產養殖、加工中的應用

MT 能作為飼料添加劑用于水產養殖中，不僅可以增強水生生物的免疫力和去除重金屬，還能用作生長激素促進水生生物的生長繁殖[50 ]。在水產品加工過程中，根據MT與重金屬的螯合功能有望將MT制成微型顆粒用于水產品中重金屬的去除[51]。

6結語

隨著 MT逐漸走入人們的視野，MT獨特的生物學功能吸引學者不斷地深入研究。在應對大量MT產品需求時，快速得到純度高的MT標準品開發技術成為關鍵。不同的分離純化方法又決定著 MT產品的純度和提取率，所以根據不同的來源及產品采取不同的分離純化方法變得至關重要。目前，對其研究仍有很大發展空間，MT獨特的生物學作用機制仍處于推測和假說階段，如何快速分離出純度高的 MT 方法仍有待發掘。因此，深入研究MT，在不久的將來MT 必將在食品、醫藥、保健、環境、化妝品、生物工程等領域中發揮更大的作用，并擁有更廣闊的市場前景。

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