重金屬暴露引起魚體氧化應激反應的研究進展

羅其勇

摘要綜述了水體中重金屬對魚類氧化脅迫的影響，介紹魚類在受到重金屬暴露后機體組織總抗氧化酶（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽轉移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性變化以及谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量變化來反映其受到重金屬毒性作用情況，以期通過監測魚體內抗氧化物質的變化來反應水體中重金屬的污染情況，也為魚類養殖的水體條件監測提供參考資料。

關鍵詞重金屬；活性氧；氧化脅迫；魚

中圖分類號S912文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0032-04

Research Progress on Oxidative Stress Reaction of Fish Body Caused by Heavy Metals

LUO Qiyong1，2

（1.Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou ， Guangxi 545006； 2. Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development， Ministry of Education；School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715）

AbstractEffect of heavy metals in water on oxidative stress of fish was reviewed . The antioxidants would change， such as total antioxidant enzymes （TAOC）， and superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione transferase （GST）， glutathione reductase （GR）， glutathione peroxidase （GPx） activity and content of glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA）， it would reflect the toxic when fish were exposed by heavy metals. It can reflect the pollution of heavy metals in the water by monitoring the change of antioxidant in the fish，and provide reference for monitoring water condition of fish culturing.

Key wordsHeavy metals；Reactive oxygen species （ROS）；Oxidative stress；Fish

重金屬及其類似物引起的水生環境污染，造成水生生物中毒效應及其毒性作用機制一直都是國內外水生生態環境研究領域的熱點[1-3]。重金屬在流入水中會經過吸附、沉淀以及絡合等作用在水環境中不斷轉移，或被水生生物積累后隨著食物鏈逐級傳遞后放大[3]。魚類是水生生態系統中重要的生物，是水生食物鏈的關鍵載體，從較低營養級到最高營養級水平都有分布，在水生生態系統中發揮至關重要作用，常被用來作為水生生態系統健康狀況的指示生物[4-5]。

魚體內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是代謝過程中不可或缺的產物，通常情況活性氧的產生與清除處于動態平衡，而外來因素溫度、重金屬、有機污染物等影響，會打破其平衡狀態。如圖1所示，正常生理條件下，魚體內ROS處于產生和清除動態平衡狀態，而外來因素影響，平衡發生改變。在魚抗氧化脅迫能力范圍，極端氧化條件會提升其體內ROS水平，魚通過自身清除能力，回到最初氧化平衡狀態稱為“急性氧化脅迫”；一旦ROS含量超過魚體的清除能力，引起產生與清除狀態失衡。魚體抗氧化效率降低，使其遭受一段時間氧化脅迫才逐漸恢復到最初平衡狀態，這稱為“慢性氧化脅迫”；此外，有些條件下魚體ROS水平未能達到最初的平衡點，經過調節而產生新的平衡點且處于平衡狀態，這樣的情況成為“ROS趨勢穩定水平”[5]。當體內ROS水平超過魚體應對抗氧化協調能力范圍，會引起魚體發生氧化損傷，嚴重時甚至引起死亡。

魚類對重金屬污染物敏感的特異性可作為評估污染物毒性強弱的關鍵因素。已有研究表明魚類對許多污染物的敏感存在物種差異性[1-3]。銅（Cu）和鋅（Zn）是魚類生長代謝過程中所必需元素，在細胞生物化學反應需要一定量Cu和Zn參與[6]，然而一旦體內Cu、Zn含量超過魚體耐受水平會對其產生毒害影響[5，7]。魚鰓長期與外界環境直接接觸，是水體途徑重金屬暴露最初目標器官，Cu在鰓大量累積引起組織器官產生大量活性氧物質（ROS）進而造成機體的氧化損傷[8]。在Cu水體暴露實驗中，黃鱸對Cu的耐受性遠高于虹鱒（Oncorhynchus mykiss）和銀鯽（Carassius auratus gibelio），而銀鯽對Cu耐受性又強于虹鱒和鯉魚（Cyprinus carpio）[9-10]。魚類的耐受性與其組織器官應抗氧化脅迫的能力存在極大關聯，組織器官會根據需要產生抗氧化物質來清除ROS來應對對抗氧化脅迫。

該研究主要介紹魚類應對重金屬誘導的氧化脅迫產生和清除機制。此外，對重金屬誘導魚類體內氧化脅迫的原因進行分析，以期通過監測生物體內抗氧化物質的變化情況，反應水體中一段時間內重金屬的污染情況，為魚類養殖的水體條件監測提供參考，也為魚類受外來污染物的影響體內抗氧化物質的研究提供基礎資料。

1活性氧的種類

活性氧主要包括以下幾種物質：超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（hydroxyl radical，·OH）、過氧化氫[hydrogen peroxide（H2O2）]、單線態氧（singlet oxygen，1O2）等[11-12]。重金屬誘發ROS的能力常被認為是其毒性的一種表現[13]，ROS是結構不穩定活性分子，容易發生氧化反應[14]，引起脂肪、蛋白質以及DNA的損傷[15]，并會引起造成一系列生理功能改變以及代謝機制紊亂，對魚體傷害，甚至死亡。H2O2易與還原性金屬（Fe和Cu）發生芬頓反應（Fenton reactions）生成羥基自由基（hydroxyl radical，·OH）[16]。Pb、Cd和Hg等金屬元素與抗氧化細胞合成抗氧化物，如谷胱甘肽、含巰基的蛋白質等[16]。此外，重金屬會誘導活性氧產生[4，16]。需要保持ROS產生與清除處于平衡狀態，以防止代謝紊亂或氧化脅迫的爆發。為應對氧化脅迫，機體需要合成各類抗氧化物質來清除ROS，以降低其對機體的損傷作用[17]。在這些抗氧化物質中，可以分為非酶促系統物質，如：抗壞血酸、維生素E和谷胱甘肽等[18]；抗氧化酶系統物質有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽轉移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和過氧化氫酶（CAT）等，其中抗氧化物質用來應對ROS氧化脅迫，保護組織免受ROS傷害[2，8，17]。

2活性氧的重要標志物

2.1總抗氧化能力（T-AOC）

T-AOC常作為評估抗氧化酶系統功能的綜合指標，其活性情況用來反映機體在應對外來刺激，非酶系統和酶系統的代償能力和自由基團的代謝狀態，也可反映非酶系統和酶系統的整體抗氧化能力的強弱，是反應機體抗氧化能力的綜合性指標。重金屬Hg暴露會造成劍尾魚（Xiphophorus helleri Heckel）鰓和肝組織中T-AOC活性分別下降39%和30%，表明重金屬暴露會降低魚體的總抗氧化能力[19]。羅非魚在投喂含有Pb的食物，結果發現腎臟，肝臟中的T-AOC活性隨著食物中鉛濃度升高呈逐漸降低[20]。以上結果發現，無論是從水體還是食物途徑重金屬暴露都會對魚體T-AOC產生影響，因此，T-AOC活性情況常被用來作為魚類受到重金屬脅迫應答反應的重要指標。

2.2谷胱甘肽（GSH）含量變化情況

在魚體內眾多非酶抗氧化物中，GSH是由（γ-glutamate-cysteine-glycine（γ-Glu-Cys-Gly））三種氨基通過肽鍵縮合而成的化合物，在魚體內有廣泛的分布，尤其肝臟組織中含量最高，具有解毒和抗氧化功能是細胞應對ROS脅迫的最重要物質，能夠降低ROS引起的氧化損傷[21]。GSH有活躍的巰基（-SH）與重金屬有強烈的親和能力，形成水溶性共價化合物，通過硫醇尿酸的形式排出體外，保護細胞免受毒性傷害。牙鲆（Paralichthys olivaceus）仔魚和幼魚在Cd暴露會引起GSH含量的升高[22]，作者認為是機體代償性機制應對重金屬引起的氧化脅迫；羅非魚（Oreochromis niloticus）在受到5種重金屬（Cd、Cu、Cr、Pb、Zn）暴露，肝臟組織中GSH含量顯著降低，表明重金屬暴露會消耗體內GSH來緩解重金屬引起的氧化脅迫[23]。因此，重金屬暴露引起GSH發生改變，表明GSH能對重金屬暴露做出很好的應答反應，因此，常常被用來作為水生生物受重金屬暴露脅迫的標志物。

2.3谷胱甘肽轉移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性變化情況

在谷胱甘肽（GSH）參與的氧化還原反應過程中，涉及到許多相關酶如谷胱甘肽轉移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等。谷胱甘肽還原酶（GR）是在氧化型谷胱甘肽（GSSH）還原成還原型谷胱甘肽（GSH）過程中，以NADPH為氫供體、氧化型谷胱甘肽為氫受體的還原酶，反應生成NADP+和還原型谷胱甘肽。GR活性的強弱會直接影響GSSH還原成GSH的結果。研究表明細胞中高濃度的金屬會抑制GR活性，同時使GSH含量的降低，結果導致組織細胞受到氧化傷害[24]。GR受重金屬的影響會表現出時間和濃度效應，此外，魚類和重金屬種類的差異會引起其應答反應有不同表現。Hg累積會降低GSH水平和抑制GR活性，使抗氧化防御系統改變，引起組織氧化損傷[24-25]。Eroglu 等[23]研究了羅非魚在5種重金屬（Cd、Cu、Cr、Pb、Zn）暴露下，肝組織中GR活性隨著暴露時間表現出先升后降低的趨勢。研究者認為GR活性降低會引起GSSG水平升高[24]，GSH應對ROS清除是一個完整的系統，如果魚體酶系統和非酶系統的調節平衡被打破，機體清除自由基和蛋白質親和重金屬的能力就會降低，使機體清除ROS下降，造成機體氧化損傷。

GPx是由硒半胱氨酸構成其活性中心的一種過氧化物酶，在機體內有廣泛的分布，由GSH提供H+，以H2O2為底物，把具有氧化能力的過氧化物（有機氫過氧化物（ROOH）還原成為無毒的羥基化合物（醇（ROH）），是防止生物膜脂質過氧化重要反應，并使H2O2分解成H2O，GSH還原成GSSH，從而對細胞膜的結構和功能起到保護作用，免受過氧化物的傷害。眾所周知，CAT也具有清除H2O2的能力，那么，GPx與CAT作用條件有何區別呢？有研究表明：只有當細胞中H2O2變化程度較小的情況GPx優先參與保護反應。GPx活性變化情況與魚類、重金屬的種類以及暴露濃度及時間密切相關。矛尾復鰕虎魚（Synechogobius hasta）受到水體中Cd暴露，肝、鰓、腎組織中的GPx活性隨著暴露濃度呈逐漸降低趨勢，在0.17和0.29 mg/L兩個暴露暴露組GPx活性均顯著低于對照組[26]。食物鉛暴露也降低了羅非魚腎臟中GPx的活性[20]。而Eroglu等[23]發現羅非魚在Cd在1 mg/L水體暴露1、7、14 d肝組織中GPx活性被誘導；水體中Zn暴露30 d鯽魚（Carassius auratus）肝臟中的GPx活性也表現出誘導升高的趨勢。

谷胱甘肽轉移酶（GST）是一種主要在肝臟中分布的酶，具有清除過氧化物和解毒雙重功能，可以使外源或內源的毒性分子失去活性轉變為水溶性化合物，完成解毒作用，因此是多種生物內主要的Ⅱ相代謝反應重要轉移酶。魚體組織器官GST活性變化有多種方式[2，27]。淡水鱧（C.punctatus）受CdCl2暴露96 h，肝、鰓和腎組織中的GST活性都顯著高于對照組[27]。青鳉（Japanese flounder）胚胎和仔魚受到48.1和 99.4 μg/L HgCl2短時間暴露，GST活性顯著低于對照組，GST活性的降低，認為是由于Hg的濃度過高產生的不利影響已經超過了自身的調節范圍[28]。而尼羅羅非魚3 mg/L Cd暴露在1、5、10、20和40 d肝臟中GST活性先升高后降低，作者認為在短期內魚體肝組織先表現出應激機制，能夠對Cd暴露作出快速應答反應，而長期的暴露是由應激反應轉化為解毒機制[29]。

2.4超氧化物歧化酶（SOD）活性變化情況

超氧化物歧化酶（SOD）是清除ROS的主要酶類，在動物、植物、微生物體內都有廣泛的存在，能夠催化超氧陰離子與氫離子反應，生成H2O2和O2，H2O2在CAT或GPx的作用下進一步的分解為無毒害作用的O2和H2O[2]。但重金屬等外源因子導致生物體內的超氧陰離子升高時，SOD活性常常被誘導，以保持細胞內ROS清除與產生之間的動態平衡[11]。但是外源因子作用已超過機體的極限水平，ROS就會在細胞內累積，會對機體產生不可逆轉的氧化應激。金魚在低濃度短期暴露時，SOD活性被誘導，當暴露濃度≥0.4 mg/L，SOD活性被抑制[30]。

2.5過氧化氫酶（CAT）活性變化情況

CAT是抗氧化防御系統關鍵酶之一，能夠把超氧化物歧化酶（SOD）歧化產生超氧陰離子的產物H2O2催化反應生成H2O和O2，所以通常認為CAT與SOD一起構成了生物體抗氧化防御系統的第一道防線[25，31]。機體在遭受重金屬暴露引起CAT活性變化的情況時常與SOD活性變化情況一致。水體Cd暴露矛尾復鰕虎魚肝、鰓和腎組織中CAT活性隨著暴露濃度逐漸降低，其變化趨勢與SOD的變化趨勢相同[26]。而虹鱒、鯉魚和銀鯽受銅暴露后鰓組織中CAT和SOD活性分別在3 d、12 h和24 h均表現出誘導升高的趨勢[32]。

2.6脂質過氧化（LPO）

脂質過氧化是生物體細胞受到氧化脅迫和損傷的標志，在抗氧化防御系統中的抗氧化物質不能夠中和ROS而引起脂膜發生過氧化[33]。活性氧（羥基自由基·OH）很容易攻擊生物膜上的磷脂、膜受體和酶相關多不飽和脂肪酸等大分子物質，從而引起脂質發生過氧化生成脂質過氧化物，如丙二醛（Malonaldehyde，MDA），影響細胞膜的通透性和流動性，結果導致細胞結構和功能發生改變[33]。由于MDA是脂質過氧化的終產物，因此MDA含量水平常被用來反映ROS引起機體脂質過氧化程度的指標[26]。多數研究表明重金屬暴露會引起魚類MDA含量的升高。水體中0.75 mg/L的鉛暴露會金頭鯛（Sparus aurata）肝組織中的MDA含量，表明Pb暴露會使其脂質過氧化程度加劇[34]；牙鲆在2、4、8 mg/L 鎘暴露會引起機體MDA含量升高趨勢[22]。然而在牙鲆仔魚（Paralichthys olivaceus）和幼魚受到HgCl2暴露，其變態仔魚期和底棲仔魚時期MDA含量與對照組無明顯差異，只是在幼魚時期升高[28]。

3結語

生物體的有氧活動中自由基的產生是必不可少的，處于產生和清除是一個持續動態平衡狀態。水生生物的多樣性和其生理狀態可直接反應水體質量情況，而水體質量是決定魚體生長發育的關鍵因素。由于重金屬在魚體含量發生改變，會引起魚體ROS的產生提高，或降低了ROS的清除能力，或對這些過程都影響，對魚體代謝的關鍵點和關鍵過程發生改變，擾亂魚體最初活性氧自由基的動態平衡狀態，對其造成氧化脅迫。因此活性氧自由基的活性情況通常用來作為環境變化的標志物，也可以用于實驗室條件下模擬自然條件，來評估和預測自然水體受重金屬暴露而引起的水體變化情況。在本綜述中，通過概述魚體在收到重金屬暴露而引起各種組織器官的變化情況可以選作為重金屬暴露魚體變化的標志物。其實在關于重金屬暴露引起氧化脅迫的標志物這方面還有很多新的設想，可以從分子結構來闡述重金屬暴露會引起活性的變化情況，更深層次的了解重金屬暴露引起魚體氧化脅迫的原因。

安徽農業科學2018年

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