義烏小鯢微衛星位點的跨種擴增

劉盼 陳雅琴 邵晨

摘要 [目的]篩選具有多態性的義烏小鯢（Hynobius yiwuensis）微衛星位點。[方法]采用跨種擴增的方法從安吉小鯢 （H.amjiensis） 和中國小鯢 （H.chinensis） 的113個微衛星位點中篩選具有多態性的義烏小鯢微衛星位點。[結果]篩選出11個具有多態性的義烏小鯢微衛星位點。這些多態性微衛星位點的等位基因數為2～6個 （平均3.55），觀察雜合度為0.200～1.000 （平均0.510），期望雜合度為0.500～0.732 （平均0.662），多態信息含量為0.375～0.737 （平均0.588）。[結論]篩選得到的具有多態性的11個義烏小鯢微衛星位點可應用于其種群遺傳學和保護遺傳學的研究。

關鍵詞 義烏小鯢；微衛星；跨種擴增；多態性

中圖分類號 Q959.5+3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）20-0083-03

Abstract [Objective]To screen the polymorphic microsatellite loci of Hynobius yiwuensis.[Method]Polymorphic microsatellite loci of H.yiwuensis were developed from 113 microsatellite loci from H.amjiensis and H.chinensis using crossspecies amplification.[Result]11 polymorphic microsatellite loci of H.yiwuensis were developed.The number of alleles， observed and expected heterozygosities and polymorphic information content of these polymorphic loci were ranged from 2 to 6 with an average of 3.55 alleles per locus， 0.200 to 1.000 （average 0.510）， 0.500 to 0.732 （average 0.662） and 0.375 to 0.737（average 0.588），respectively.[Conclusion]These 11 polymorphic microsatellite loci of H.yiwuensis can be used in population genetic and conservation genetic researches.

Key words Hynobius yiwuensis；Microsatellite；Crossspecies amplification；Polymorphism

微衛星 （microsatellite） 又稱簡單重復序列 （simple sequence repeat，SSR） 或短串聯重復序列 （short tandem repeats， STRs），是廣泛存在于真核生物基因組中的一種特殊序列，主要由1～6個核苷酸的串聯重復單元組成[1]。由于微衛星具有高度的多態性、呈共顯性標記、選擇中性及相對較高的突變速率等特征，而被廣泛應用于物種種群遺傳結構[2]、基因流及進化史分析，物種分類和親緣關系鑒定和種群數量調查等[3]方面。

義烏小鯢[4]（Hynobius yiwuensis）隸屬于兩棲綱（Amphibia）、有尾目（Caudata）、小鯢科（Hynobiidae）、小鯢屬（Hynobius），是我國特有種。目前該鯢僅分布于浙江地區（舟山、鎮海、蕭山、義烏、溫嶺、江山）海拔100～200 m植被較繁茂的丘陵山區[5]。近年來，適宜于義烏小鯢棲息的生境不斷喪失或被破壞，導致義烏小鯢種群數量急劇下降，其被國際自然保護聯盟紅色名錄（IUCN Red List）[6]和中國脊椎動物紅色名錄[7]列為易危等級。當前對義烏小鯢的研究多集中于對物種分類地位[4]、組織學[8]和基本遺傳學[9-10]的探討，在物種遺傳多樣性、物種種群的遺傳結構以及基因流等種群遺傳學方面的研究鮮見報道。為保護該物種，同時為發掘該物種的遺傳資源，并為后續物種遺傳現狀的評估提供重要的技術方法支持，筆者擬通過采用跨種擴增的方法，從安吉小鯢 （H.amjiensis） 和中國小鯢 （H.chinensis） 已有微衛星位點中篩選出具有多態性的義烏小鯢微衛星位點，以期通過這些位點很好地反映義烏小鯢的種群結構、遺傳多樣性、有效種群大小以及基因流等保護遺傳學和種群遺傳學信息。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

于2015年1月在浙江舟山島不同樣點不同卵帶中分別采集2～3枚義烏小鯢卵粒樣本，共采集到30個卵帶中的76枚卵粒。將采集到的卵粒保存在盛有無水乙醇的離心管中，并將其余的卵粒原地放回，將樣本帶回實驗室用于DNA提取。

1.2 基因組DNA的提取

取30個不同卵帶中的卵粒各1枚，用無菌水清洗3～4次后剪碎，再用經典的Sambrook[11]基因組DNA提取方法從卵粒中提取基因組DNA。

1.3 微衛星備擇位點的選取

通常，跨種擴增微衛星位點選取自與目標研究物種親緣關系較近的物種。在該研究中，100個安吉小鯢（H.amjiensis）微衛星位點（未發表）和13個中國小鯢（H.chinensis）微衛星位點（NCBI上已發表）被用于義烏小鯢微衛星位點的開發中。

1.4 微衛星位點的檢測

為避免由于等位基因丟失所造成的無效PCR擴增，該研究以義烏小鯢8個基因組DNA為混合模板，對上述113個備擇位點進行溫度梯度（48～62 ℃）和Mg2+濃度梯度（1.5、2.0、2.5 mmol/L）的PCR擴增反應。反應體系如下：10 × PCR buffer 2 μL； Mg2+ （25 mmol/L）3個梯度分別為1.2、1.6和2.0 μL； dNTP （ 2.5 mmol/L） 1.6 μL； 上游和下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL； 模板DNA 0.8 μL； rTaq （5 U/μL） 0.16 μL； 雙蒸水補足至20 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；最后72 ℃延伸7 min。

上述PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將得到單一條帶的位點進行多態性檢驗。以30個不同卵帶的義烏小鯢卵粒基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系和反應條件同上，僅改變退火溫度為上述位點初篩時所得到單一條帶時確定的溫度。PCR產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經銀染[11]等過程進行檢測。

1.5 等位基因有效性再確認

將經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后含多態性的位點合成具有熒光標記的上游引物（FAM和HEX修飾），PCR擴增具有特定等位基因片段的個體，經SSR分型和測序確認微衛星等位基因的有效性、片段大小以及各等位基因的序列組成。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

試驗提取的30個義烏小鯢卵粒基因組DNA經NanoDrop （Thermo Scientific Inc.）檢測其濃度為122.7～248.5 ng/μL，OD260/280介于1.8～1.9，表明DNA的濃度和純度均較好。

2.2 微衛星引物篩選結果

在備選的113對近緣物種的引物中，有52對引物得到了單一、穩定的擴增條帶，占據總數的46.0%。來自安吉小鯢的100對引物中共有50對引物可以進行穩定的特異性擴增，約占總數的50.0%；來自中國小鯢的13對引物中，僅有2對可以進行特異性的穩定擴增，約占總數的15.4%，較安吉小鯢來說，比例較低。而其余的61個位點中，有11個位點（9.7%）出現了非特異性的擴增，50個位點（44.2%）顯示并無具體的擴增產物產生。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，結果如下（圖1）。

2.3 具有多態性的微衛星位點篩選結果

在上述可獲得單一、穩定擴增條帶的52個微衛星位點中，經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和微衛星分型及測序，共獲得具有多態性的微衛星位點11個，占總數的21.2%（表1）。圖2為引物Hyyi70的STR掃描測序結果。

3 討論

利用微衛星重復序列兩端相對保守的側翼序列來進行跨物種微衛星位點的篩選是開發物種特異微衛星位點的方法之一。該方法由于具有開發時間短、花費相對較少、成功率高等特點而被廣泛應用于脊椎動物各類群和昆蟲的研究中。如董穎等[12]通過跨種擴增在赤點石斑魚（Epinephelussp）中成功篩選到12個具有多態性的微衛星位點；黃族豪等[13]利用家雞（Gallus gallus）的微衛星位點對灰胸竹雞（Bambusicola thoracica）進行跨種擴增， 最終得到10個多態位點；利用大鼠（Rattus norvegicus）和小鼠（Mus musculus）已知的微衛星位點在黃毛鼠（R.lossea Swinhoe）中篩選到8個多態性微衛星位點[14]；而已知的21個中華鱉（Trionyx sinensis）的微衛星位點則可用于8個近緣物種的跨物種擴增[15]；此外，陳東海等[16]和Kim等[17]分別在兩棲動物虎紋蛙 （Hoplobatrachus chinensis） 和昆蟲小紅蜻蜓 （Nannophya pygmaea） 中通過跨種擴增獲得了物種特異的微衛星位點。該研究通過利用113個安吉小鯢和中國小鯢的微衛星位點成功篩選得到11個具有多態性的義烏小鯢微衛星位點，這也再次證明了跨物種篩選是獲取物種特異微衛星位點的重要方法。

然而，對于不同的目標物種，其跨種擴增的成功率卻有顯著差異。如在哺乳動物中，其微衛星位點的跨種擴增成功率為56%左右[18]；在鳥類的微衛星跨種擴增研究中其成功率約為91%[19]；而在蛙類中其成功率僅為11%～29%[20]。導致不同類群微衛星位點跨種擴增成功率相差較大的原因可能是：①不同類群物種的基因組大小相差較大，兩棲動物的基因組大小約是哺乳類的2倍，鳥類的4倍。物種的基因組越大，其基因序列相似性的概率越低，其跨種擴增的成功率就越低。因此，不同類群物種進行微衛星位點的跨物種擴增其成功率相差較大。此前也有研究指出物種在進行微衛星位點的跨種PCR擴增時，其成功率與物種的基因組大小呈負相關[21]。②不同研究中備擇微衛星位點的來源物種與目標研究物種之間的親緣關系不同。親緣關系越近，其基因序列組成越相似，序列越保守，跨種擴增的成功率也將越高。劉羅等[22]用烏龜（Mauremys reevesii）的微衛星位點分別對來自于同科和不同科的7個物種進行跨種擴增，結果發現與烏龜同科物種的跨種擴增成功率要遠遠高于不同科物種的擴增成功率；而選用異齒裂腹魚（Schizothorax oconnori）的微衛星位點對來自于同屬和不同屬的5個物種進行跨種擴增，發現同屬之間的跨種擴增成功率要高于不同屬之間的物種[23]。以較近親緣關系物種的微衛星位點為目標物種的備擇位點將使得跨物種PCR擴增具有更高的成功率。

兩棲動物作為脊椎動物從水生過渡到陸生的重要類群，一直以來在生態系統中扮演了重要的角色。然而，近年來由于氣候變暖、棲息地破碎化及喪失、捕獵和疾病等原因，其種群下降速率一直居于脊椎動物第1位，全球評估發現有42.5%的兩棲類動物數量呈下降趨勢[24]。為保護該類群，兩棲動物的保護遺傳學和種群遺傳學研究得到極大發展[25-27]。義烏小鯢是受人為活動影響較大的兩棲有尾類物種之一，隨城市化發展和經濟作物的種植，適合義烏小鯢生存的棲息地發生劇烈的改變，導致義烏小鯢適生環境減少。該研究篩選到的具有多態性的11個義烏小鯢微衛星位點，可有效用于義烏小鯢種群結構、遺傳多樣性、有效種群大小以及基因流等保護遺傳學和種群遺傳學研究，從而為保護該物種提供重要的技術方法支持。

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