中藥渣抗藥性轉(zhuǎn)化菌的篩選及酶活性測(cè)定

張義剛 聶銘 胡留杰 孫志洪 陳霞 謝永紅

摘? ?要? ?以藥渣和纖維素為唯一碳源，通過平板初篩及多種酶活綜合測(cè)定復(fù)篩，從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復(fù)合菌系Y-5，從Y-5供試樣品中分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株，其中細(xì)菌54株，真菌18株，通過菌群耦合培養(yǎng)，獲得了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的YEM耦合菌群，對(duì)中藥渣的降解能力提高64.6%。

關(guān)鍵詞? ?中藥渣;抗藥性轉(zhuǎn)化菌;篩選

中圖分類號(hào)：S182? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.008

西南地區(qū)是中藥材生產(chǎn)和加工的核心區(qū)，如重慶太極、云南白藥和貴州百靈等幾十家全國大型中成藥制藥企業(yè)均在此設(shè)立工廠。據(jù)估計(jì)，我國中藥企業(yè)每年要消耗植物類藥材數(shù)百萬噸，隨之產(chǎn)生的植物類藥渣多達(dá)幾千萬噸（含水分）[1]。這些藥渣造成大量環(huán)境污染，如何有效處理是一個(gè)令人深感棘手的大問題。中藥渣中含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和生物堿等主要組分，其中包括難以降解的生物堿、纖維素和木質(zhì)素。傳統(tǒng)的堆肥處理存在周期長、發(fā)酵不充分等問題，其主要原因在于藥渣具有較強(qiáng)的抑菌性，一般的堆肥菌劑微生物在藥渣中成活率低，生長速度慢，形成不了穩(wěn)定的高活性菌群[2-3]。目前，關(guān)于纖維素降解菌和纖維素酶的研究報(bào)道較多[4-8]，主要集中于對(duì)秸稈、糞便的降解，而關(guān)于對(duì)中藥渣降解的報(bào)道則較少[9-12]。本試驗(yàn)以中藥渣為降解源，擬從腐熟藥渣中初步篩選出高效無毒的抗藥性藥渣降解菌，再進(jìn)行復(fù)篩，同時(shí)對(duì)其酶活性進(jìn)行測(cè)定，以便開發(fā)出用于藥渣好氧堆肥處理的高效微生物菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 含菌樣品

2014年5月，在太極集團(tuán)涪陵制藥廠藥渣堆放區(qū)和重慶土原生物科技有限公司藥渣堆肥區(qū)，采集腐熟藥渣樣品4份及長期堆放藥渣的表層土壤4份。采集樣品后立即帶回實(shí)驗(yàn)室接種，進(jìn)行富集培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

本試驗(yàn)中使用富集培養(yǎng)基、CMC-Na固體培養(yǎng)基、纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基及液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基等，其具體配置方法參照郭建軍等[13]。

1.2 方法

1.2.1 菌種富集

稱取菌種來源樣品5 g，加入以藥渣為唯一碳源的100 mL富集培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的富集培養(yǎng)基，富集3代。

1.2.2 菌種初篩和復(fù)篩

取富集3代的培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋，在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上分離純化菌種，觀察平皿上是否出現(xiàn)水解環(huán)及水解環(huán)的大小;初步比較不同菌株的纖維素酶酶活，并確定用于酶活測(cè)定的菌株。將分離得到的優(yōu)勢(shì)菌株分別接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在37 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，將發(fā)酵液用2層紗布過濾，濾液于4 ℃、5 000 r·min-1離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.2.3 菌群耦合培養(yǎng)

用產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基將復(fù)選所得的菌株與TEM菌株等比例混合培養(yǎng)，形成TSM、YEM菌群，耦合菌群在2%菌種接種量、32 ℃培養(yǎng)溫度、每2 h通氣10 min、通氣量300 ml·min-1條件下培養(yǎng)5 d，測(cè)定各組合菌群的酶活性。

1.2.4 酶活性測(cè)定

采用DNS 還原糖法測(cè)定各纖維素酶酶活性，包括全酶活性（FPA）、內(nèi)切酶酶活性（Cx）和外切酶酶活性（CI）[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩結(jié)果

將腐熟藥渣及堆放土壤樣品，在以藥渣為唯一碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行3代富集。從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復(fù)合菌系Y-5，在50 ℃靜止培養(yǎng)條件下，在第7天可使濾紙的分解率達(dá)到83%，其中對(duì)纖維素、半纖維素的分解率分別為75%、78%。復(fù)合菌系Y-5經(jīng)過3次富集培養(yǎng)，菌系種類組成和分解能力都具有較好的穩(wěn)定性，生長速度快。利用CMC分離培養(yǎng)基50 ℃培養(yǎng)分離復(fù)合菌系Y-5中的菌株，分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株，其中細(xì)菌54株、真菌18株，主要由芽孢桿菌屬、梭菌屬和瘤胃桿菌屬組成。分離得到的纖維素降解菌能快速地在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生清亮的水解環(huán)，其中L1和L2菌株在平板上較快地產(chǎn)生了較大的水解環(huán)。

2.2 菌種復(fù)篩結(jié)果

纖維素的降解是多酶體系作用的結(jié)果，選擇測(cè)定降解圈、Cx、CI、FPA 3 種酶活性大小作為菌種的復(fù)篩依據(jù)。將菌種分別接入以藥渣和CMC-Na為碳源的固體培養(yǎng)基和液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基。通過CMC-Na固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，有8個(gè)菌株快速形成菌落和CMC降解圈。菌斑測(cè)定結(jié)果（見表1）表明，L2菌落直徑最大，對(duì)CMC-Na的降解率最高，平均降解率達(dá)到4.03%;其余菌株的平均降解率均大于2%，表明8個(gè)復(fù)選菌株都具有較強(qiáng)的纖維素分解能力。

通過藥渣和CMC-Na 為碳源的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后的酶活測(cè)定結(jié)果見表2。對(duì)于FPA活性，以藥渣為碳源的真菌L2菌株最高，達(dá)到8.13 U·mL-1，其次較高的菌株為細(xì)菌2#、細(xì)菌5#、真菌L1和細(xì)菌3#，F(xiàn)PA活性均大于6 U·mL-1。以CMC-Na 為碳源的真菌L1 FPA活性最高，達(dá)到8.52 U·mL-1，其次真菌L2和細(xì)菌2#相對(duì)較高。對(duì)于Cx活性，真菌L2和細(xì)菌2#在藥渣和CMC-Na中碳源均較高，但真菌L1對(duì)藥渣的外切分解能力較弱，且它們的Cx與其他菌相比差異較大。對(duì)于CI活性，在藥渣和CMC-Na碳源中，真菌L2、細(xì)菌1#、細(xì)菌2#的活性較高，但真菌L1在外切酶和總酶活性上較差。這些表明真菌L2和細(xì)菌2#菌株降解藥渣和纖維素的能力比其他菌株要強(qiáng)，酶活測(cè)定結(jié)果與水解環(huán)測(cè)定結(jié)果基本吻合。

2.3 菌群耦合結(jié)果

YEM菌種培養(yǎng)周期為5 d，培養(yǎng)72 h各組合菌群的菌液OD600均達(dá)到1.25以上，活菌數(shù)量大于15億/mL，YEM耦合菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

通過酶活性測(cè)定結(jié)果（見表3）表明，YEM組合菌群無論是在藥渣或CMC-Na基質(zhì)中的纖維素酶全酶活性FPA顯著高于單一菌株的酶活性。常規(guī)堆肥TEM菌群在CMC-Na基質(zhì)中表現(xiàn)出較高的FPA活性，但在以中藥渣為單一基質(zhì)中的FPA活性較低。YEM組合菌群因添加了對(duì)藥渣降解能力較強(qiáng)的菌株，其纖維素全酶活性在藥渣和CMC-Na基質(zhì)中都表現(xiàn)出明顯增加趨勢(shì)，其中在藥渣基質(zhì)中FPA活性提高64.6%，在CMC-Na基質(zhì)中也提高25.4%。篩選的抗藥性藥渣降解菌株真菌L2、細(xì)菌2#具有良好的共生增效特性，與EM耦合菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，增效明顯，YEM菌群在中藥渣處理中具有廣泛的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

針對(duì)中藥渣的抑菌特性，從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復(fù)合菌系Y-5，在50 ℃靜止培養(yǎng)條件下，在第7天可使濾紙的分解率達(dá)到83%，其中對(duì)纖維素、半纖維素的分解率分別為75%、78%。利用CMC-Na分離培養(yǎng)基50 ℃培養(yǎng)分離，從Y-5供試樣品中分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株，其中細(xì)菌54株、真菌18株;利用剛果紅纖維素篩選培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步篩選，得到具有較強(qiáng)纖維素降解能力的菌株8株，其中細(xì)菌6株、真菌2株，復(fù)選菌株對(duì)纖維素的降解率均大于3.0%。通過藥渣基質(zhì)和CMC-Na基質(zhì)產(chǎn)酶活性測(cè)定，篩選出真菌L2和細(xì)菌2#菌株對(duì)藥渣和纖維素降解能力都強(qiáng)的抗藥性菌株。通過菌群耦合培養(yǎng)，獲得了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的YEM耦合菌群，菌種培養(yǎng)5 d活菌數(shù)量大于15億/ml，YEM菌劑的纖維素酶活性較Em菌劑提高25.4%～64.6%，尤其是對(duì)中藥渣的降解能力提高64.6%，在中藥渣處理中具有廣泛的應(yīng)用前景。

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