基于功能組分提升的藥渣濾液培養技術研究

陳霞 胡留杰 聶銘 孫志洪 謝永紅

摘? ?要? ?中藥渣濾液已經成為制約中藥材產業綠色發展的關鍵問題。以藿香正氣液藥渣濾液為原料，以YEM為菌劑，研究了其發酵基質、參數及發酵組分變化，以期為藥渣濾液的快速微生物處理與高效利用提供技術支撐。研究結果表明，藿香正氣液藥渣濾液發酵培養基適宜配比為：添加蔗糖3%、硫酸銨0.3%、硝酸鈣0.1%、復合氨基酸0.4%、磷酸二氫鉀0.2%;適宜的菌種接種量為2%，適宜的培養溫度為30 ℃，適宜的通氣量為200 mL/（min·m3）。整個發酵期間，藥渣水發酵液總黃酮含量增加36.9%，標志性藥效成分從發酵前的10種增加到發酵后的16種，有8種主要藥效成分的峰面積顯著增加，藥用組分峰面積增加40%，藥效組分含量總體提高。

關鍵詞? ?藥渣濾液;菌劑;培養基;發酵;功能組分

中圖分類號：Q946;S182? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.010

藥渣濾液成分復雜，具有污染物濃度高、色度深、可生化性差、毒性強、難降解等特點，其處理利用一直是亟待解決的難點。傳統藥渣濾液處理沿用工業污水處理排放工藝，藥效資源未能有效利用。目前制藥廢水處理技術主要包括吸附法、光降解法、膜分離法、厭氧法、好氧法等，以微生物厭氧、好氧及其組合工藝較為普遍。微生物發酵顯著提高藥渣濾液的有效組分和藥效，在動物保健領域具有廣泛的應用前景。韓春楊等利用由黃芪、黨參、茯苓、山楂、麥芽和白術通過微生物發酵處理，發酵前后中藥制劑液相色譜圖對比表明，中藥在發酵過程中，經過微生物的降解作用和細胞壁的分解，有效成分可以最大限度游離出來，使得藥物成分有所增加，并且含量比發酵前升高了很多。但不同藥渣濾液間其發酵微生物菌種、發酵基質與參數等均有所不同。本文以藿香正氣液藥渣濾液為原料，以前期篩選出的抗藥性YEM菌株為菌劑，研究了藥渣濾液發酵基質、參數等兼氧連續發酵工藝，同時對其組分變化進行了測定，為藥渣濾液的快速微生物處理與高效利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藥渣濾液：取自太極集團涪陵制藥廠藿香正氣液藥渣壓榨水。藥渣水顏色深褐色，pH值為6.5～6.8，懸浮顆粒含量1.2%～1.5%，COD為9 300～9 800 mg·L-1，TSS含量2.9%～3.1%，含總氮800～870 mg·L-1、總糖1 050～1 120 mg·L-1、總黃酮870～960 mg·L-1。試驗菌劑為本課題組前期分離出的YEM菌劑。

1.2 試驗方法

發酵培養基配方試驗：按L16（45）正交表進行藥渣濾液處理培養基配方試驗。各因素和水平：蔗糖添加比例設置為2%、3%、4%、5%四個水平，硫酸銨添加比例設置為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%四個水平，硝酸鈣添加比例設置為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%四個水平，復合氨基酸添加比例設置為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%四個水平，磷酸二氫鉀添加比例設置為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%四個水平。將100 mL培養基裝于250 mL三角瓶內，棉塞密封并121 ℃滅菌，冷卻后每瓶培養基接種2 mL YEM菌劑活化液，于25 ℃培養5 d，取發酵液測定菌液OD550值。

發酵參數試驗：利用優化培養基配方，在50 L發酵罐中設置1%、2%、3%菌種接種量，25 ℃、30 ℃、35 ℃培養溫度，100， 200， 300 mL/（min·m3）充氣量，進行單因素試驗，每天取發酵液測定菌液OD550值。

藥渣濾液發酵試驗：在150 L發酵罐中，按最佳發酵參數與藥渣濾液培養基配方進行發酵處理，每天取樣測定菌液OD550值和進行組分檢測。

1.3 測定指標和方法

發酵液光密度采用550 nm分光光度法測定;COD采用多參數水質分析儀測定;粗纖維含量采用重量法測定;粗蛋白含量采用凱氏定氮法測定;總黃酮含量采用360 nm分光光度法測定。

發酵液組分測定：液相色譜法。將發酵前后的液體樣品分別以8 000 r·min-1離心5 min，取上清液進行液相色譜測定。液相色譜條件如下。1）色譜柱，鉆石C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;2）檢測器，Waters2487紫外雙波長檢測器;3）流動相，A. pH值為3.25的磷酸溶液，B. 乙腈;二元梯度洗脫，洗脫條件為：0～5 min，A（%）10-10，B（%）90-90;5～25 min，A（%）10- 20，B（%）90-80;2～27 min，A（%）20-30，B（%）80-70 ;27～38 min，A（%）30-35，B（%）70 -65;38～40 min，A（%）35-40，B（%）65-60;40～50 min，A（%）40-40，B（%）60-60;檢測波長：280 nm;檢測柱溫25 ℃;靈敏度0. 8AUFS;流速1 mL·min-1;樣品進樣量5 μL。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基配方篩選

發酵培養基配方試驗結果（見表1）表明，各添加組分對菌株生長都有顯著影響。根據試驗結果的極差分析，在藥渣水培養基中，硫酸銨和蔗糖的添加比例對發酵菌株的生長影響最大，其次是硝酸鈣，復合氨基酸和磷酸二氫鉀的添加比例對菌株生長的影響相對較小。從各添加組分的效應分析可知，藥渣濾液發酵培養基適宜配比為：蔗糖3%、硫酸銨0.3%、硝酸鈣0.1%、復合氨基酸0.4%、磷酸二氫鉀0.2%。

2.2 藥渣濾液發酵條件優化

2.2.1 溫度

從圖1可知，在25～35 ℃溫度范圍，發酵菌株在中藥渣水培養基中均能正常生長，隨著時間的增加，表現出先升后降的規律。與25 ℃培養條件相比，30 ℃培養的菌株活菌數量顯著增加，菌株最大生長量在接種培養5 d到達，比25 ℃培養提前1 d;而35 ℃培養條件下，單培養基中活菌數量無明顯增加，而且在發酵培養6 d以后菌株老化嚴重，活菌數量下降較快。可見，在藥渣發酵處理中適宜的培養溫度為30 ℃，可保障菌株在藥渣水培養基的快速生長，保持菌株活性。

2.2.2 接種量

從圖2可知，YEM菌劑3種不同接種量在藥渣濾液培養基中菌株的生長速度差異明顯，其中1%的菌種接種量啟動速度慢，在7 d以后才達到較高的活菌密度;3%接種量處理提前達到活菌最大值，但后期菌株老化較快;2%菌種處理具有明顯的菌株對數生長期，藥渣濾液培養基中活菌數量多，穩定時期較長，利于藥渣濾液的降解轉化。因此認為，在藥渣濾液培養基中適宜的菌種接種量為2%。

2.2.3 通氣量

由于藥渣水組分復雜，在微生物降解過程中需要厭氧和好養處理，才能降解木質素、纖維素和分解細胞壁，同時將粗蛋白轉化為氨基酸等小分子物質。通過每間隔2 h通氣10 min發酵罐內好養、厭氧循環處理過程，以進一步提高微生物對藥渣濾液的處理效果。不同通氣量試驗結果見圖3，可以看出，在低通氣量100 mL/（min·m3）條件下，培養液中菌株生長緩慢，以厭氧菌為主要優勢菌種;在高通氣量300 mL/（min·m3）條件下，培養液中菌株前期生長快，而且活菌數量較多，以好養菌為主要優勢菌種;在200 mL/（min·m3）條件下，培養液中菌株前期生長快，而且活菌數量最多，活性保持時間長。分析主要原因為適宜的通氣量利于在發酵罐中形成穩定的厭氧和好養循環環境，利于各種菌株的生長，充分發揮厭氧菌和好養菌的降解功能。由此認為，在藥渣濾液微生物發酵處理中，適宜的通氣量為200 mL/（min·m3），利于形成穩定的厭氧和好養循環發酵環境。

2.3 藥渣濾液微生物培養效果

采用150 L發酵罐在優化的藥渣濾液培養基配方和發酵控制參數條件下進行藥渣濾液微生物發酵處理，結果見表2。在藥渣濾液培養基中發酵微生物菌株在發酵后4～5 d達到最大活菌密度，發酵液OD550達到1.83;隨著培養液中養分的消耗降低，微生物數量逐漸減少。發酵液pH值從6.8下降到3.5左右，一直保持酸性狀態，主要原因為發酵過程中產生大量乳酸。發酵液COD在發酵初期變化較小，與發酵液中微生物數量少、酶活性低有關;在發酵4 d后，發酵液COD顯著下降，到第6天后COD維持在700 mg·L-1以下較低水平，呈緩慢下降趨勢，在整個發酵處理過程中，COD下降94.6%。發酵液中纖維素的降解與COD變化規律一致，在整個發酵過程中纖維素降解率達97.3%，后期發酵液中纖維素含量低于45 mg·L-1。發酵液中粗蛋白含量隨發酵時間的延長而增加，其增加速度與微生物數量增加基本同步，在整個發酵處理過程中，藥渣濾液粗蛋白含量增加4～5倍，維持在1 100～1 280 mg·L-1范圍。從發酵液中微生物生長及主要物質的降解動態分析，整個藥渣水微生物處理周期為7 d以內。

2.4 藥渣濾液發酵液組分與含量的變化

藥渣水發酵液總黃酮含量的變化：由表2可見，藥渣水在微生物發酵過程中總黃酮含量逐漸增加，尤其是發酵后4～6 d微生物數量和酶活性快速增加期間，發酵液總黃酮含量快速提高，后期穩定在1 250～1 280 mg·L-1范圍，整個發酵期間，藥渣水發酵液總黃酮含量增加36.9%。

藥渣水發酵液組分的變化：對藥渣水微生物發酵前后各組分液相色譜分離檢測結果表明，絕大多數吸收峰的保留時間一致，其中7個主要藥效成分保留時間一致。發酵后的制劑中標志性藥效成分從發酵前的10種增加到發酵后的16種，有8種主要藥效成分的峰面積顯著增加，藥用組分峰面積增加40%，表明藥效組分含量總體提高，與發酵液中總黃酮含量增加36.4%的結果一致。

3 結論

用選育的YEM抗藥性菌劑進行藥渣廢濾液發酵處理，通過正交試驗優化獲得藥渣濾液發酵培養基適宜配比為：添加蔗糖3%、硫酸銨0.3%、硝酸鈣0.1%、復合氨基酸0.4%、磷酸二氫鉀0.2%。在pH值為6.5，2%菌種接種量，30 ℃培養溫度和每間隔2 h通氣10 min，通氣量200 mL/（min·m3）條件下，藥渣濾液發酵周期為7 d，實現藥渣廢濾液連續進料快速微生物處理;在藥渣濾液功能組分提升定向培養過程中COD下降94.6%，纖維素降解97.3%，粗蛋白含量增加4～5倍，總黃酮含量增加36.4%，發酵液氣味清香;通過發酵前后的藥劑色譜圖比較，絕大多數吸收峰的保留時間一致，發酵后的制劑中標志性藥效成分從發酵前的10種增加到發酵后的16種，有8種主要藥效成分的峰面積顯著增加，藥用組分含量總體提高40%左右;說明發酵處理增加了藥渣水藥效組分，提高了藥效有關成分含量。