絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4在動脈粥樣硬化易損斑塊形成中的調節作用

陶曉芳 王雅潔 王文斌 費年華

咸寧市中心醫院（湖北科技學院附屬第一醫院）1老年病科，2甲狀腺乳腺外科（湖北咸寧 437000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病的主要病因［1］。大約60%的心肌梗死是由斑塊破裂引起的［2］。易損的AS 斑塊具有脆弱、不穩定的結構，是急性冠脈綜合征最常見的病因［3］。越來越多的證據表明，細胞凋亡是易損斑塊形成的關鍵。抑制細胞凋亡可抑制斑塊破裂并預防急性心血管事件［4］。研究發現，血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）通過對高血壓的間接誘導作用和對血管壁的直接作用來介導AS 發病機制［5］。動物和臨床試驗證明，Ang Ⅱ受體阻滯劑可以降低斑塊破裂和冠狀動脈血栓形成的風險［6-7］。然而，Ang Ⅱ介導的易破裂斑塊形成的潛在機制需要進一步研究。絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4，MAP4K4）是哺乳動物STE20/MAP4K 家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與多種生物過程，例如細胞運動、細胞增殖和細胞骨架的重排［8］。已發現Map4k4 可加速AS 和血管炎癥［9］。最近一項研究表明，小鼠骨髓間充質干細胞分泌的外泌體通過抑制Map4k4 減緩ApoE-/-小鼠AS 斑塊的形成［10］。然而，Map4k4 與AS 斑塊穩定性之間的關聯尚不清楚。因此，本研究假設Map4k4 可能參與AngⅡ對AS 病變中巨噬細胞凋亡和斑塊穩定性的影響。為了驗證這一假設，研究采用Ang Ⅱ聯合或不聯合Lenti-shMap4k4 和Lenti-Map4k4 處理ApoE-/-小鼠和小鼠腹腔巨噬細胞，探討Map4k4 在巨噬細胞凋亡和AS 斑塊易損性中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物實驗分組 32只雄性ApoE-/-小鼠（6 ～8周齡）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠在標準條件［溫度（22 ± 1）℃；濕度55% ～60%；12 h明暗循環］下飼養，可自由獲取水和食物。適應一周后，將小鼠隨機分為四組（每組8 只）：Control組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+ shMap4k4（shMap4k4）組（小鼠尾靜脈注射Lenti-shMap4k4）和AngⅡ+ Map4k4（Map4k4）組（小鼠尾靜脈注射Lenti-Map4k4）。除Control 組小鼠外，Ang Ⅱ組小鼠按照標準量［1 000 ng/（min·kg）］配制微量滲透泵，并在常規麻醉下埋入頸背部皮下12周。在給予Ang Ⅱ4周和8周時，Ang Ⅱ+shMap4k4組通過鼠尾靜脈向小鼠注射100 μL攜帶shMap4k4的慢病毒（1×108TU/mL），和Ang Ⅱ+Map4k4 組通過鼠尾靜脈向小鼠注射100 μL攜帶Map4k4質粒的慢病毒（1×108TU/mL）。在研究結束時（埋入頸背部皮下12 周后，即實驗開始后第13 周的第1 天），處死小鼠，收集標本。本研究已通過本院倫理委員會審查（批號：2019 第（03）號）。

1.2 細胞培養和轉染 通過用冰冷的Dulbecco 改良的Eagle′s 中/高糖（DMEM，美國Hyclone 公司）沖洗腹腔分離C57BL6J雄性小鼠腹腔巨噬細胞。細胞接種在含10%胎牛血清（Hyclone）和1%青霉素/鏈霉素（美國Gibco 公司）的DMEM/高糖培養基中培養。巨噬細胞用不同濃度Ang Ⅱ（0、5、100、200、500、1 000 μmol/L）處理24 h或200 μmol/L Ang Ⅱ處理不同時間（0、6、12、24、48 h），通過Western blot 分析巨噬細胞中Map4k4 蛋白表達情況。為了敲低Map4k4 或過度表達Map4k4，用慢病毒攜帶靶向小鼠Map4k4的shRNA（GGACCAAGTTAGGTTCCAGCTAA，漢恒生物科技（上海）有限公司）（Lenti-shMap4k4）或含有啟動子Map4k4 上游區域的質粒構建物（漢恒生物科技（上海）有限公司）（Lenti-Map4k4）轉染巨噬細胞48 h。為了考察Map4k4 對Ang Ⅱ誘導的小鼠腹腔巨噬細胞凋亡影響，將細胞實驗分為兩部分，第一部分考察Map4k4 敲低對巨噬細胞凋亡影響，細胞分為：Control 組、Ang Ⅱ組、shMap4k4 組、Ang Ⅱ+shMap4k4組。其中，Control組加入DMSO處理24 h；Ang Ⅱ組加入200 μmol/L Ang Ⅱ處理24 h；shMap4k4 組用shMap4k4 轉染巨噬細胞48 h，加入DMSO處理24 h；Ang Ⅱ+shMap4k4組用shMap4k4轉染巨噬細胞48 h，加入200 μmol/L Ang Ⅱ處理24 h。第二部分考察Map4k4 過表達對巨噬細胞凋亡影響，細胞分為：Control 組、Ang Ⅱ組、Map4k4 組、Ang Ⅱ+Map4k4 組。其中，Control 組加入DMSO 處理24 h；Ang Ⅱ組加入200 μmol/L Ang Ⅱ處理24 h；Map4k4組用Map4k4轉染巨噬細胞48 h，加入DMSO處理24 h；Ang Ⅱ+Map4k4組用Map4k4轉染巨噬細胞48 h，加入200 μmol/L Ang Ⅱ處理24 h。

1.3 Western blot 分析 使用RIPA 從巨噬細胞中提取總蛋白。并使用BCA 法（美國Pierce 公司）測定蛋白質濃度。樣品（各20 μg）在10%SDS-PAGE凝膠上分離，并轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore 公司）。膜用5%脫脂牛奶封閉后，與不同的一級抗體孵育過夜：Map4k4（英國Abcam 公司），抗切割半胱天冬酶3（c-Caspase3，美國CST 公司），抗Bcl-2（CST），抗Bax（CST）和β-actin（美國Sigma-Aldrich 公司）（稀釋度均為1∶1 000）。然后用PBS 清洗膜，并用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的山羊抗兔二級抗體（Abcam；1∶10 000）在室溫下孵育1 h。洗滌后，PVDF 膜與ECL 底物一起孵育以在印跡上產生化學發光。利用Image J 進行密度分析，定量蛋白質條帶。

1.4 RNA分離和實時定量PCR 使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）從培養細胞中分離總RNA。純化的RNA 通過使用逆轉錄第一鏈cDNA 合成試劑盒（日本Takara 公司）反轉錄成cDNA，并通過SYBR Premix Ex TaqTMII（Takara）進行實時定量PCR 分析。使用標準的2-ΔΔCt（周期閾值）方法測定mRNAs 的相對表達水平。β-actin 作為內源性對照用于標準化。本研究中的引物為：小鼠Map4k4：（正向）：5′-GAAGCAAGAGAGAGAGAGCAAGAG-3′（反向）：5′-CCTCGAGAGAGAGAGAGAG-3′；小鼠β-actin（正向）：5′-GTGACGTTGACATCCGTAAA-3′（反向）：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACA-3′。

1.5 組織病理學染色和免疫熒光分析 對所有小鼠，采集主動脈根部包埋在最佳切割溫度的化合物（OCT）中，然后連續切片成6 μm厚的切片。切片用蘇木精/伊紅（HE）、油紅O（Sigma）、Masson 染色（北京Solaibio公司）和抗α-SMA抗體（Abcam，1∶150）和抗F4/80 抗體（Abcam，1∶100）染色。油紅O 染色用于脂質積累分析；Masson 染色用于膠原分析；α-肌動蛋白免疫熒光染色用于平滑肌細胞分析；F4/80染色用于巨噬細胞分析。切片通過F4/80和Map4k4一級抗體的雙重免疫熒光染色，并在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下與特異性熒光標記二級抗體孵育2 h。使用熒光倒置顯微鏡捕獲熒光信號，并使用Image J 對F4/80+Map4k4+細胞進行量化。斑塊易損性指數=（巨噬細胞+脂質核心）陽性染色面積/（平滑肌細胞+膠原）陽性染色面積。

1.6 TUNEL 染色 采用原位TUNEL 試劑盒（瑞士Roche 公司）檢測AS 病變中的細胞凋亡。小鼠主動脈根部的F4/80+TUNEL+細胞首先用F4/80+一抗在37 ℃染色2 h，然后依次與FITC 標記的山羊抗小鼠IgG 抗體和TUNEL 反應混合物在37 ℃孵育1 h。使用熒光倒置顯微鏡捕獲熒光信號，并使用Image J 進行量化。

1.7 血漿AngⅡ水平分析 從小鼠眼眶靜脈收集血樣。根據小鼠外周血Ang ⅡELISA 檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）檢測血漿AngⅡ水平。

1.8 統計學方法 所有統計分析均由Graph Prism 5.0 進行。數據表示為平均值±標準差。兩組之間的比較采用Student′st檢驗。多組比較采用單向方差分析和Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AngⅡ加劇ApoE-/-小鼠AS 發展并促進斑塊易損性 為了證實AngⅡ誘導的AngⅡ動脈粥樣硬化小鼠模型（Ang Ⅱ組小鼠），研究首先檢測了小鼠血漿Ang Ⅱ濃度，發現Ang Ⅱ組小鼠血漿Ang Ⅱ濃度較Control 組顯著升高（P＜0.01，圖1A）。與Control 組相比，Ang Ⅱ組小鼠主動脈根部的壞死核心大小顯著擴大（P＜0.01，圖1B-D）。此外，Ang Ⅱ組小鼠顯示巨噬細胞數量增加（P＜0.01），但病變區域的膠原沉積減少（P＜0.01），平滑肌細胞數量減少（P＜0.01），表明存在易損斑塊表型（圖1E-J）。

圖1 Ang Ⅱ加劇ApoE-/-小鼠AS 的發展并促進斑塊易損性Fig.1 Ang Ⅱaggravated the development of AS and promoted plaque vulnerability in ApoE-/-mice

2.2 AngⅡ誘導巨噬細胞凋亡，并在體內外上調Map4k4 通過TUNEL 和F4/80 聯合染色，結果發現，AngⅡ組小鼠主動脈根部中巨噬細胞的凋亡比例高于Control 組（P＜0.05，圖2A），并且AngⅡ組小鼠斑塊內巨噬細胞中Map4k4 的表達顯著上調（P＜0.05，圖2B）。與體內結果一致，AngⅡ顯著增加小鼠腹腔巨噬細胞Map4k4 的表達（P＜0.05），并在200 μmol/L Ang Ⅱ和處理24 h時達到峰值（圖2C）。

圖2 AngⅡ誘導巨噬細胞凋亡，并在體內外上調Map4k4Fig.2 AngⅡinduced apoptosis of macrophages and up-regulated Map4k4 in vitro and in vivo

2.3 Map4k4介導AngⅡ處理的ApoE-/-小鼠AS病變的發展和易損斑塊的形成 為了評估AngⅡ存在時Map4k4對AS的影響，通過尾靜脈注射Lenti-Map4k4 shRNA 來抑制Map4k4 表達或Lenti-Map4k4 來誘導小鼠中Map4k4過度表達。通過實時PCR 檢測證實在主動脈中出現Map4k4 抑制或過表達（P＜0.05，圖3A）。各組小鼠血漿Ang Ⅱ濃度均在15 μmol/L以上，不受慢病毒注射的影響（圖3B）。與AngⅡ組小鼠相比，AngⅡ+shMap4k4 組小鼠的主動脈根部壞死核心大小顯著減少，但在Ang Ⅱ+Map4k4 組小鼠中顯著增加（P＜0.05，圖3C-E）。同時，AngⅡ+shMap4k4 組顯著降低了脂質積累、巨噬細胞浸潤和斑塊易損指數（均P＜0.05），并增加了斑塊內的膠原沉積和平滑肌細胞數量（均P＜0.05），而Ang Ⅱ+Map4k4 組的作用相反（圖3F-K）。

圖3 Map4k4 介導AngⅡ處理的ApoE-/-小鼠AS 病變的發展和易損斑塊的形成Fig.3 Map4k4 mediated the development of AS lesions and the formation of vulnerable plaques in AngⅡ-treated ApoE-/-mice

2.4 Map4k4 通過減少巨噬細胞凋亡促進AngⅡAS 小鼠易損斑塊的形成 使用Map4k4 和F4/80共染色評估了Map4k4 在AS 斑塊巨噬細胞中的表達，發現AngⅡ組中Map4k4+F4/80+細胞的數量顯著增加（P＜0.05），修飾的慢病毒可以有效地敲低或上調Map4k4（P＜0.05，圖4A）。然后使用具有F4/80 共染色的TUNEL 檢測巨噬細胞中的細胞凋亡。與AngⅡ組小鼠相比，AngⅡ+Map4k4 組增加了TUNEL+F4/80+細胞的數量（P＜0.05）。而AngⅡ+shMap4k4 組沉默了Map4k4 會減少TUNEL+F4/80+細胞的數量（P＜0.05），見圖4B。

圖4 Map4k4 通過減少巨噬細胞凋亡促進Ang ⅡAS 小鼠易損斑塊的形成（n=6）Fig.4 Map4k4 promoted the formation of vulnerable plaques in Ang ⅡAS mice by reducing macrophage apoptosis（n=6）

2.5 Map4k4 促進AngⅡ誘導的小鼠腹腔巨噬細胞凋亡 使用修飾的慢病毒轉染實現了巨噬細胞中的Map4k4 敲低或過表達。Map4k4 敲低有效減弱了AngⅡ誘導的c-Caspase3、Bax 蛋白表達增強（P＜0.05），并增強了Bcl-2 蛋白表達（P＜0.05）。而Map4k4 過表達進一步增強了Ang Ⅱ的誘導作用（P＜0.05，圖5A-B）。

圖5 Map4k4 促進Ang Ⅱ誘導的小鼠腹腔巨噬細胞凋亡（n=3）Fig.5 Map4k4 promoted Ang Ⅱ-induced apoptosis of mouse peritoneal macrophages（n=3）

3 討論

急性冠狀動脈綜合征是常見的臨床事件，會導致相當大的即刻死亡和冠狀動脈意外發生。進一步了解斑塊破裂的分子機制對于探索新的急性冠狀動脈綜合征治療靶點至關重要［11］。AngⅡ作為一種有效的促炎細胞因子，其通過調節氧化應激、炎癥反應和細胞增殖來促進AS，但潛在機制仍未明確［12］。先前研究報道，AngⅡ通過促進巨噬細胞中的組蛋白甲基化和抑制膽固醇流出來促進AS 的進展［13］。觀察性研究表明，AngⅡ是急性心血管事件的獨立危險因素。最近，急性冠脈綜合征隊列研究也證實了AngⅡ與斑塊進展之間的關聯［14］。然而，沒有直接證據表明AngⅡ與巨噬細胞凋亡有關。本研究發現AngⅡ可以加速ApoE-/-小鼠AS 斑塊的進展并促進斑塊的不穩定性，包括更大的主動脈根部的病變面積和壞死核心，更多的巨噬細胞浸潤以及病變區域的膠原沉積和平滑肌細胞數量減少。此外，TUNEL 染色表明巨噬細胞凋亡與AngⅡ誘導的ApoE-/-小鼠中不穩定斑塊形成有關。最重要的是，AngⅡ上調了巨噬細胞中Map4k4 的表達。沉默Map4k4 可防止AngⅡ誘導的巨噬細胞凋亡和AS 中易損斑塊的形成，表明Map4k4 可能是AngⅡ誘導AS 的潛在治療靶點。

AS 是血管死亡的主要原因，通常由斑塊破裂引起，進而導致血栓形成和血管閉塞［15-16］。巨噬細胞凋亡是AS 斑塊發展的一個重要特征［17］。巨噬細胞凋亡極大地促進了不穩定的斑塊形成，并且隨著斑塊中巨噬細胞凋亡的積累，壞死核心的形成加速，斑塊容易破裂［18-19］。最終可能會發生與急性動脈粥樣硬化血栓形成相關的血管疾病。研究表明，Map4k4 是一種促炎激酶，并且是介導多種細胞類型中TNF-α 的有害功能所必需的［20-21］。最近研究發現，巨噬細胞Map4k4 可調節細胞因子的釋放，巨噬細胞衍生的細胞因子可促進小鼠和人類AS的進展［22］。因此，使用基因缺失策略敲低巨噬細胞中Map4k4表達可以改善AS［10］。本研究發現AngⅡ在體內和體外均促進巨噬細胞凋亡，并誘導Map4k4+F4/80+細胞的數量顯著增加。通過沉默Map4k4會減少TUNEL+F4/80+細胞的數量，相應的斑塊中脂質積累、巨噬細胞浸潤和斑塊易損指數降低，并增加了斑塊內的膠原沉積和平滑肌細胞數量。此外，敲低Ang Ⅱ處理的巨噬細胞中Map4k4表達可以抑制caspase-3 的激活，下調了促凋亡Bax 的表達并上調了抗凋亡Bcl-2 的表達。總之，Map4k4在Ang Ⅱ誘導的巨噬細胞凋亡和易損AS斑塊的發展中起重要作用。但是，本研究沒有測試該調節中的其他凋亡途徑，仍需要在未來進行探索。

總之，本研究發現Ang Ⅱ通過上調Map4k4 表達促進巨噬細胞凋亡，并進一步參與AS 中易損斑塊的形成。Map4k4 可能是Ang Ⅱ誘導的AS 的潛在治療靶點。深入了解Map4k4 對易損斑塊形成的作用機制可能為預防急性冠狀動脈綜合征和不良心血管事件提供新的治療方法。