甘蔗無根試管苗光合自養生根過程中葉片生理生化特征的變化

劉麗敏 何為中 劉紅堅 余坤興 范業賡 翁夢苓

摘 要 甘蔗光合自養生根技術是一種新型的試管苗生根方法，比傳統的培養基異養生根法有顯著優勢。為了揭示甘蔗生根的生理生化機理，為完善其生根技術提供理論依據。本研究以甘蔗栽培品種桂糖44號無根試管苗為材料，噴施ABT2號生根粉溶液后移栽于沙土混合基質中，在普通日光溫室進行自養生根。在生根過程中連續采樣調查試管苗生根率和生長狀態，檢測葉片中總葉綠素、碳水化合物（蔗糖、可溶性糖）、三大內源激素（IAA、ABA、CTK）含量和過氧化物酶（POD）活性。結果表明，由于環境改變，試管苗受到環境脅迫，致使葉片先微黃后轉綠，7 d后老葉變黃衰老，新葉開始長出，并與日俱增；第一批不定根在處理后第5天突破表皮，至第9天100%的試管苗完成不定根的再生。葉綠素含量先減少后增加而后下降，9 d后跳躍上升；蔗糖、可溶性糖含量先是呈波動上升后急劇下降再跳躍上升；ABA含量和POD活性先上升后下降；IAA和CTK含量則相反，先下降后上升。從試管苗生長狀態和生理生化指標變化規律分析，本研究發現甘蔗試管苗光合自養生根過程分為3個階段，第一階段在0～7 d，為試管苗適應期；第二階段在7～9 d，為試管苗異養自養切換期；第三階段在9～15 d，為試管苗自養能力恢復期，試管苗成功過渡到自養階段是試管苗獲得高存活率的必要條件。

關鍵詞 甘蔗；試管苗；光合自養生根；葉片；生理生化

中圖分類號 S566.1 文獻標識碼 A

Abstract Photoautotrophic rooting technique is newly developed for in vitro sugarcane plantlets， which has a significant advantage over the conventional heterotrophic rooting technique. The purpose of this study is to reveal the physiological and biochemical mechanism of the new rooting technique， and ultimately to provide a theoretical basis for improving the technology. In this study， the sugarcane cultivar GT44 was used as the explant， and the in vitro sugarcane plantlets were transplanted in the mixed sandy soil substrate for photoautotrophic rooting in the sunlight greenhouse after sprayed with ABT 2 rooting powder solution and hardened for 24 h. During the rooting process， samples were taken continuously to investigate the rooting rate and growth status， the total chlorophyll， carbohydrates （sucrose， soluble sugars）， three types of endogenous hormones （IAA， ABA， CTK） contents and peroxidase （POD） activity in the leaves were detected. The results showed that the plantlets were stressed and got yellow slightly in the leaves due to environmental changes， then turned green. Seven days later the older leaves turned yellow and aging， but more new leaves appeared. The first signed adventitious roots broke through the epidermis at 5 d and 100% of plantlets completed their regeneration of adventitious roots before 9 d. The chlorophyll content decreased firstly then increased and decreased， but jumped up after 9 d. The sucrose and soluble sugar contents at first steadily increased then drastically declined from day 7 to day 9 and later jumped up. The ABA content and POD activity increased at first and then decreased. The contents of IAA and CTK were declined at first and then increased， which was in opposite to that of ABA. The findings of the study suggested that photoautotrophic rooting of sugarcane in vitro plantlets was divided into three phases： the first was the adaptation phase from 0 d to 7 d， the second was the heterotrophic-autotrophic switching phase from 7 d to 9 d， and the third was the autotrophic function recovery phase from 9 d to 15 d. Successful recovery of the autotrophic function was essential for high survival of sugarcane plantlets.

Key words sugarcane； in vitro plantlet； photoautotrophic rooting； leaf； physiology and biochemistry

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.006

糖業是廣西最重要和最有代表性的傳統優勢產業之一，食糖年產量占全國總產量的60%以上，涉及90多個縣（市、區）、2 000多萬農業人口、10多萬產業工人[1-2]。廣西糖業發展事關我國食糖供給安全，在促進經濟發展、保障財政收入、實現農民增收、促進民族團結和邊疆鞏固安寧等方面都發揮了重要作用。甘蔗種莖是甘蔗生產中產量和品質形成基礎，因此，甘蔗良種繁育是甘蔗生產中的一項非常重要的工作。目前，甘蔗組織培養技術已經廣泛應用于良種快速繁育和健康種苗生產，傳統的試管苗生產流程要經過初代培養、增殖培養、生根培養和移栽4個階段，生產工藝復雜，耗時長，生產成本高。為了降低生產成本，本課題組在國內最新研發了甘蔗試管苗光合自養生根技術。該技術是將試管苗的生根和馴化結合起來，省去了試管苗瓶內生根的傳統程序。這樣減少了一次無菌操作的步驟，提高了培養室的利用率，簡化了組培程序，提高了生產效率，降低了生產成本。但該技術存在試管苗生根不穩定、品種間存在差異、生根苗恢復慢等問題。甘蔗試管苗光合自養生根是試管苗從異養過渡到自養的生長適應過程，試管苗從室內人工控制的最適宜生長環境轉移到室外自然環境，由于試管苗一直處于非自然環境中生長，適應自然環境的能力差，環境脅迫壓力大；另一方面，試管苗的不定根的再生和芽苗生長需要消耗大量的營養物質。因此，通過測量甘蔗試管苗在光自養生根過程中一些生理生化指標可以進一步研究試管苗在生根過程中的生理生化變化規律及生根機理。目前相關研究主要集中在外部因素（如溫度、濕度和光強）、栽培基質和激素處理的篩選等方面[3-6]，有關甘蔗無根試管苗自養條件下生根過程中葉片生理生化指標變化特征報道極少[7-8]。Barlow等[9]認為早期陸地植物根的進化與持續增長的光合效率有關，根被用作是消除過多由光合作用產生碳的工具，證據是植物苗根（shoot-borne root）生長部位常位于碳水化合物富集部位，如葉片基部或節。

光合作用通過碳同化為植株提供能量，光合器官的馴化對試管苗的存活以及對苗和根的其他代謝途徑馴化有重要影響[10]。激素在調控植物生根發育的過程中，會通過調控植物體內一系列的生化活動來配合根原基的誘導和發育[11-13]。內源激素IAA的含量高低與試管苗生根密切相關，外源激素可以通過調節內源激素水平，間接影響不定根形成及根系的形成和發育。Husen[14]報道，外源激素IBA處理黃檀（Dalbergia sissoo）插條誘導不定根發育的過程中，可溶性糖和淀粉含量不斷下降，蛋白質和PER酶活性先升高后下降，這些代謝變化與扦插枝條的根原基發育有關，同時也意味著IBA的使用激活了糖代謝，釋放了能力。Klerk[15]報道，在蘋果微枝培養生根過程中，外源激素處理后的24 h內，基部細胞受生長素激素刺激出現淀粉，然后在不定根誘導階段淀粉粒降解成單糖，供應細胞分裂。激素也影響著葉片的衰老，IAA和CTK為抑制葉片早衰的激素，ABA為促進葉片衰老的激素[16-17]。IAA抗衰老效果較小，CTK延緩葉片衰老效果明顯，對離體葉片的抗衰老效果尤其明顯[15-16]。ABA促進植物葉片的衰老，影響細胞膜的透性，加速葉片的衰老[15]。

目前的研究普遍認為植物的生長過程與植物內源激素水平及各激素間相互平衡有密切關系，因而探討各種激素間的比例關系具有一定的價值。Hou等[18]在研究不同增殖代數板栗試管苗葉片內源激素對不定根發育的影響中發現，IAA/ABA、IAA/CTK的比值隨著增殖代數變大，生根率也隨之增大，說明IAA/ABA、IAA/CTK的比值大，有利于不定根的誘導發育。因此，本研究以甘蔗栽培品種桂糖44號的無根試管苗為材料，于噴施生根液前后，取樣測量葉片中總葉綠素、蔗糖、可溶性糖、過氧化物酶（POD）和三大內源激素[吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、細胞分裂素（CTK）]等生理生化指標，研究甘蔗試管苗光合自養生根過程中生理生化指標的動態變化特征，探索試管苗光合自養生根機理，為進一步研究甘蔗不定根發育和完善生根技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為廣西農科院甘蔗研究所培育的甘蔗（Saccharum L. hybrid.cv））新品種‘桂糖44號增殖期的無根試管苗，由廣西農科院甘蔗研究所生物室提供。該試管苗的培養條件如下：培養基為MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，繼代培養周期為15 d；室內培養條件為溫度（28±2）℃，濕度60%～70%；光源為日光燈，光照時間12～18 h/d，光強（2 500±300） lx。

1.2 方法

1.2.1 試管苗噴施處理 試管苗預處理方法采用He等[19]的處理方法并加以改進，即使用ABT生根粉溶液噴施甘蔗無根試管苗葉片，以葉片沾滿生根液為宜，煉苗24 h后將甘蔗分叢、清洗、消毒；后種植到塑料托盤內（8伊6孔），栽培基質為沙土混合物，混合比例黃泥∶沙=1∶1，每個孔種植一叢。放置于大棚內，蓋膜，保持高溫高濕的環境，溫度20～40 ℃，濕度70%～100%，白晝光照強度控制在20 000 lx以下，但不能長時間低于2 000 lx。

1.2.2 生根率調查 噴施處理第2天，也就是移栽后第1天開始調查生根率，每次調查30叢，3次重復，統計不可自然分割個體和生根個體數量，生根率=生根個體數/自然分割個體總數×100%。

1.2.3 采樣方法 從噴施當天為0 d，移栽種植當天為1 d。噴施前開始取樣，從1～9 d，每天取樣一次，11～15 d隔天取樣一次。每次采30叢，3個重復，取同一部位（正1，2葉）綠色葉片為檢測樣品，樣品儲存在-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.4 檢測方法 葉綠素總含量測定采用張憲政[20]的方法，蔗糖測定采用紫外光比色法，可溶性糖采用蒽銅比色法、POD活性采用可見光比色法；IAA、ABA、CTK采用酶聯免疫方法測定。上述指標除葉綠素總含量外其余均委托南京建成生物工程研究所進行測量。

1.3 數據處理

圖表采用Microsoft Excel 2007繪制，試驗數據分析采用DPS16.05軟件完成。采用單因素方差分析法（one-way ANOVA）分析不同時間段的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 試管苗根系發育及葉片生長情況

結果表明，試管苗在噴施生根液處理之后第5天，開始觀察到有肉眼可見根出現，生根率為18%左右；第6天大量根系突破表皮，生根率為69%，增幅達51%（絕對值）；第7天生根率達83%。第8天生根率達90%左右，新葉開始抽出，老葉逐漸變黃，第9～15天生根率達到100%，根系逐漸伸長、數量增多，部分老葉變枯黃，新葉逐漸生長，展開變綠。

2.2 葉片葉綠素總含量變化與試管苗生根率變化的關系

葉綠素能夠吸收、傳遞和轉換光能，是植物進行光合作用的物質基礎，其含量直接影響葉片的光合速率。甘蔗無根試管苗在移栽生根的過程中，葉綠素含量呈波浪式上升趨勢。從變化的差異顯著性看，一共分為5個階段。第1個階段在噴施生根液之后的0～2 d，試管苗從室內培養的環境轉移到室外大棚，受環境變化的影響，葉綠體含量急劇降低，差異顯著（p<0.05）。第2個階段在2～6 d，試管苗根系在第5天首次突破表皮，試管苗逐漸適應外界環境，葉綠體有所恢復，葉綠素含量逐漸增加，但差異不顯著；第3階段在6～7 d，試管苗根系大量突破表皮，葉綠素含量急劇升高，在第7天達到峰值，差異顯著（p<0.05）；第4階段為第7～9天，老葉開始黃化，新葉開始生長，葉綠素含量下降；第5階段為第9天之后，試管苗生根率達100%，新葉抽出，試管苗逐漸適應外界環境，依靠自身光合作用進行生長，葉綠素含量呈穩定上升趨勢（圖1）。

2.3 葉片蔗糖含量變化與試管苗生根率變化的關系

蔗糖是光合同化物與能量的運輸和貯藏形式，是植物生長、發育過程中的重要化合物之一。如圖2所示，在0～4 d蔗糖含量差異不顯著，即葉片中蔗糖含量始終保持在試管苗增殖階段的水平。隨后在4～7 d，蔗糖含量緩慢升高，第7天達到一個階段高點，7～9 d蔗糖含量急劇下降，到第9天達到最低。隨后穩步上升，到第15天達到峰值，比較圖1和圖2可發現葉片中葉綠素含量變化曲線與蔗糖含量變化曲線在生根過程的變化趨勢非常相近。試管苗根突破表皮前葉片中蔗糖含量保持在一個穩定水平，第一批根出后至7 d蔗糖含量逐漸上升，然后生根率不斷上升，但蔗糖含量卻下降，直到9 d后，蔗糖才快速升高。蔗糖含量的變化一方面反應了試管苗光合作用的能力，另一方面也體現了試管苗根系發育的各個時期的碳水化合物需求情況。0～7 d是試管苗不定根誘導、根原基形成、根原基伸長和根突破表皮的關鍵時期，試管苗生理代謝較低，光合產物合成大于消耗，蔗糖便可以存儲下來，含量增加。7～9 d，由于根系大量生長，新葉長出，消耗大于合成，蔗糖消耗很多，因此含量急劇下降。9～15 d，根系形成，有光合能力的新葉增加代謝活動減弱，光合產物累積，蔗糖含量增加。

2.4 葉片可溶性糖含量變化與試管苗生根率變化的關系

可溶性糖是植物體內重要的營養物質，可以為植物的生長發育提供能量。如圖3所示，在試管苗光合自養生根過程中可溶性糖含量的呈倒雙峰的變化趨勢。在0～1 d含量小幅度升高，隨后1～4 d含量逐漸下降，在第4天達到第一個低谷；接著在4～8 d，含量逐漸上升，到第8天含量達到最大值，與低谷含量變化差異顯著（p<0.05）。到了第9天，含量急劇下降，與前一天的差異達到顯著水平（p<0.05）。第9天之后，含量逐步穩定上升。

2.5 葉片POD活性變化與試管苗生根率變化的關系

過氧化物酶（POD）是普遍存在高等植物體內的一類含鐵卟啉輔基的酶，亦是木質素合成的主導酶，在不定根的誘導和根原基形成過程中POD通過氧化IAA調控IAA含量而起作用。同時，POD也是植物抵抗逆境脅迫的一個重要的生理指標。如圖4所示，試管苗葉片POD活性呈雙峰變化趨勢。噴施處理之后第1天活性劇增上升，達到第一個小高峰，差異顯著（p<0.05）。第2～5天活性波動下降，到5 d達到最低點；接著5～7 d活性急劇增加，在第7天達到最高值，差異顯著（p<0.05）。在7～15 d后，POD活性曲線下降，在7～9 d降低，到第11天又輕微上升，之后活性穩定下降，差異顯著（p<0.05）。

2.6 葉片內源激素含量變化與試管苗生根率變化的關系

如圖5所示，在甘蔗試管苗光合自養生根過程中，ABA的含量變化呈雙峰變化趨勢。在未噴施處理前（0 d）為最低值，接著含量逐漸上升，并在第4天達到第一個小峰值，差異達顯著水平（p<0.05）。第5天下降隨后又增加，到第7天達到最高值。隨后含量曲線下降，在第7～9天含量下降，在9～13 d又輕微上升，但差異不顯著。13 d之后含量急劇下降，差異顯著（p<0.05）。CTK含量變化呈一個谷型變化。從0～7 d，CTK含量呈曲線下降，到第7天達到最低值。第7～15天，含量曲線上升，在7～9 d上升，隨后11 d下降，自13 d之后，含量穩定上升。在整個生根過程葉片IAA的含量都比同期的CTK和ABA含量低，且不同時間內波動幅度較小，處理前（0 d）IAA含量達到最高，處理后下降，在第7天達到最低值，7 d后含量上升，但幅度很小，從1～15 d IAA含量變動幅度不顯著。從激素的數據中可以看出，噴施處理第7天是激素變化的一個臨界點，3種激素都在這個臨界點達到最低或最高值，ABA含量達到峰值，IAA和CTK含量出現最低點，在生根過程中，內源激素含量波動幅度由大到小的排序依次是ABA含量，CTK含量和IAA含量。

2.7 葉片IAA/ABA和 IAA/CTK比值的變化與試管苗生根率變化的關系

生根過程也是多種植物激素相互協同、制約的過程，不同激素含量比值的變化更能反應不定根形成能力。在試管苗生根過程中，IAA/CTK和IAA/ABA變化趨勢相似，0～7 d從最高峰植降到最低值，7 d后生根率達到80%以上后，IAA/CTK和IAA/ABA比值又緩慢上升，不同之處是IAA/CTK比值波動幅度小，而IAA/ABA比值波動幅度比較大。

3 討論

本研究結果表明，在甘蔗試管苗光合自養生根過程中，光合作用重要指標葉綠素和蔗糖含量的變化是同步的，這可能與如下事實相關：甘蔗試管苗葉片是恒溫、恒濕和異養的人工環境下生長發育而成，其葉片與大田生長植株葉片不一樣，表現異常，沒有功能氣孔、表皮發育差和光合效率低等[9]。試管苗移栽到溫室初期（0～7 d），葉片光合器官也需經過環境適應這個過程，因此一開始并不能建立高效的光合系統，光合作用指標是緩慢升高；在7～9 d光合指標急劇下降與這個時段的試管苗生長特征有關，試管苗根突破表皮達到高峰期，試管苗生根率達到100%，新葉也不斷抽出，碳水化合物消耗量激增，而另一方面試管苗原有葉片衰老和新葉光合作用效率低等原因致使蔗糖急降；9～15 d試管苗完成了根的再生和新葉新芽不斷生長后，其光合效率顯著提高。這與Rodriguez等[10]的報道結論相似。可溶性糖含量的變化則體現了試管苗自身的能量儲備消耗與合成的比例關系。根據其變化趨勢，可能是前期激素誘導了試管苗根原基的分化，也促進了淀粉的分解，試管苗自身儲備的能量充足，消耗小于合成；中期，根系和葉片生長需要消耗大量能量，試管苗自身儲備能量減少，消耗大于合成；后期，試管苗根系已經建成，葉片已經具備光合作用，合成大于消耗。IAA含量在甘蔗試管苗光合自養生根過程的變化不大，說明IAA在整個過程中對根系的生長和葉片的衰老影響較小，但是一直保持在一個穩定的水平，對根系生長發育，延緩葉片衰老也起到一定的作用。CTK含量變化則與葉片生長的狀態有關，前期CTK降低，葉片在在逆境中逐漸衰老，后期CTK逐漸升高，葉片逐漸適應逆境，并有新葉片長。甘蔗試管苗光合自養生根過程中ABA的含量波動幅度大。體現了試管苗在光合自養生根的過程中對環境的適應能力。Chandra等[21]的研究也表明，在試管苗移栽訓化過程中，ABA在維持植株體內水分平衡和植物試管適應環境脅迫方面發揮了重要作用。葉片中內源激素及其比值的變化與傳統生根的不一致，其中的原因值得進一步的研究。過氧化物酶（POD）是IAA分解代謝的關鍵酶，它能氧化分解IAA以此來調節植物體內的生長素水平，從而保持植物的正常生長發育，調節植物體的生長的節律。本試驗結果表明，生根過程中POD活性波動很大，但IAA濃度波動幅度很小，差異不顯著。這可能與POD存在的離子態有關。有報道指出POD降解IAA具有相對性，不是所有POD同工酶帶都具有強IAA氧化能力，陽離子POD（堿性或稱高等電點POD）與IAA的親合力強于陰離POD[22-23]。

甘蔗試管苗光合自養生根過程是試管苗從異養生長逐步過渡到自養生長的過程，結合對試管苗葉片各個生理生化指標的分析，我們可以推斷，整個光合自養生根過程可以分為3個階段，即適應期、異養自養切換期和自養功能恢復期。第一階段在0～7 d，試試管苗在這個階段生長環境發生劇烈變化，試管苗生長受到環境脅迫的影響，起初葉片微黃，后慢慢轉綠，不定根的誘導、根原基的形成在這一階段完成，并有部分不定根突破表皮，形成肉眼可見根，試管苗光合系統還不完善，主要依靠自身的碳水化合物供應植株生長；第二階段在7～9 d，這個時期大部分植株不定根突破表皮，生根率達到100%，新葉開始出現，老葉衰老，呼吸作用大于光合作用，自身碳水化合物消耗大，試管苗從依靠自身碳水化合物開始轉換到依靠光合作用產物；第三階段在9～15 d，新葉抽出，不定根伸長和旺盛生長，試管苗逐漸建立自己的光合系統，根系開始吸收土壤中的營養和水分，光合作用產物逐漸供養植株生長需要。

參考文獻

[1] 段維興. 廣西蔗糖產業發展現狀及對策[J]. 中國糖料，2016（1）：65-72，75.

[2] 盧慶南，梁 賢，陸宇明，等. 論廣西蔗糖產業經濟及其發展戰略[J]. 安徽農業科學，2008，36（36）：16 095-16 096，16 224.

[3] 何為中，汪 淼，劉紅堅，等. 赤霉素（GA_3）處理對甘蔗試管苗瓶外生根的影響[J]. 安徽農業科學，2011，39（4）：2 059-2 060.

[4] 何為中，劉紅堅，李 松，等. 甘蔗試管苗瓶外生根技術的研究[J]. 安徽農業科學，2012，40（29）： 14 191-14 194.

[5] 汪 淼，方鋒學，何為中，等. 外源激素處理對甘蔗試管苗瓶外生根的影響[J]. 安徽農業科學，2012，40（16）：8 833-8 835.

[6] 劉紅堅，范業賡，何為中，等. 甘蔗試管苗瓶內生根與瓶外生根培養方法比較研究[J]. 廣東農業科學，2013，40（18）：13-15.

[7] 陳凌艷，鄭宇，陳禮光，等. 西洋杜鵑組培苗生根培養及其內源激素含量變化的研究[J]. 福建林學院學報，2011，31（2）：131-135.

[8] 范業賡，陳忠良，劉紅堅，等. 甘蔗無根試管苗移栽生根過程中內源激素和POD活性變化的研究[J]. 廣東農業科學，2013，40（3）：15-17，31.

[9] Barlow P W. The origin， diversity and biology of shoot-borne roots[M]// Davis T.D. and Haissig B.E. （Eds）. Biology of adventitious root formation. New York： Springer Science+Business Media，1994：5-7.

[10] Rodriguez R，Aragon C E，Escalona M，et al. Carbon metabolism in leaves of micropropagated sugarcane during acclimatization phase[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant，2008，44（6）：533-539.

[11] 王關林，吳海東，蘇冬霞，等. NAA、IBA對櫻桃砧木（Prunus pseudocerasus Colt）插條的生理、生化代謝和生根的影響[J]. 園藝學報，2005，32（4）：691-694

[12] 文穎強，馮嘉玥，萬春雁. ABT和CaCN2對葡萄插條萌芽生根及一些生理生化指標的影響[J]. 中國農學通報，2007，23（12）：270-273.

[13] 衛 梅，謝燕燕，陳劍峰，等. 閩西青岡組培苗生根培養及其內源激素含量變化的測定[J]. 宜春學院學報，2016，38（9）：90-94.

[14] Husen A. Clonal propagation of Dalbergia sissoo Roxb. and associated metabolic changes during adventitious root primordium development[J]. New Forests，2008，36（1）：13-27.

[15] Klerk D G J. Rooting of microcuttings： theory and practice[J]. In Vitro Cellular and Developmental Biology，2002，38（5）：415-422.

[16] 魏道智，戴新賓，許曉明，等. 植物葉片衰老機理的幾種假說[J]. 廣西植物，1998，18（1）：90-97.

[17] 馬緒亮，李合松. 雜交水稻早衰機理研究進展[J]. 湖南農業科學，2007（3）：59-61.

[18] Hou J W，Guo S J，Wang G Y. Effects of in vitro subculture on the physiological characteristics of adventitious root formation in microshoots of Castanea mollissima cv. ‘yanshanhong. Journal of Forestry Research. 2010，21（2）：155-160.

[19] He W Z，Liu L M，Liu H J，et al. Photoautotrophic rooting of sugarcane microshoots[C]// Henderson M T，Proceedings of the International Society of Sugar Cane Technologists，2016：848-851.

[20] 張憲政. 作物生理研究法[M]. 北京：農業出版社，1992：145.

[21] Chandra S，Bandopadhyay R，Kumar V，et al. Acclimatization of tissue cultured plantlets： from laboratory to land[J]. Biotechnology Letters，2010（9）：1 199-1 205.

[22] Siegel B Z. Plant peroxidases-an organismic perspective[J]. Plant Growth Regulation，1993，12（3）：303-312.

[23] Loukili A E，Limam F，Ayadi A，et al. Purification and characterization of a neutral peroxidase induced by rubbing tomato internodes[J]. Physiologia Plantarum，1999，105（1）：24-31.