用Golden Gate法構(gòu)建廣譜抗番木瓜環(huán)斑病毒海南株系的CRISPR/FnCas9植物表達(dá)載體

王緒朋　趙輝　賈瑞宗　孔華　郭運(yùn)玲　郭安平

摘 要 分子生物學(xué)育種是目前防治番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）最有效的方法。早期轉(zhuǎn)基因番木瓜抗病毒的策略是根據(jù)“致病菌衍生的抗病性”（PDR）原理，將病毒來源的基因全長序列，轉(zhuǎn)入番木瓜并獲得抗性。PDR策略最主要特點(diǎn)依賴于靶目標(biāo)病毒基因序列相似性，不能有效解決海南的番木瓜環(huán)斑病毒遺傳多樣性復(fù)雜的株系。本研究著眼于創(chuàng)制廣譜的抗PRSV新策略，用最新的CRISPR/FnCas9基因編輯技術(shù)和Golden Gate載體構(gòu)建系統(tǒng)，依據(jù)不同PRSV株系的保守序列分析結(jié)果，將5個(gè)sgRNA （2個(gè)CP sgRNA，2個(gè)Nib sgRNA和1個(gè)HC-Pro sgRNA）串聯(lián)在一個(gè)載體上，實(shí)現(xiàn)一個(gè)載體可識(shí)別剪切5個(gè)位點(diǎn)，從而達(dá)到廣譜抗PRSV的效果，應(yīng)對(duì)海南地區(qū)PRSV株系復(fù)雜的問題。目前載體已經(jīng)進(jìn)行了測序驗(yàn)證，并在番木瓜上進(jìn)行了葉片局部瞬時(shí)表達(dá)，初步表現(xiàn)出對(duì)PRSV的抑制效果，這為獲得廣譜抗番木瓜環(huán)斑病毒的番木瓜品種奠定良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 番木瓜；CRISPR；番木瓜環(huán)斑病毒；廣譜抗病；基因組編輯

中圖分類號(hào) S668.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Molecular breeding is effective approach to develop resistance papaya against Papaya ring spot virus （PRSV）. Pathogen-derived resistance （PDR） was employed in the development of transgenic papaya. Fundamentally， PDR technology is sequence homology-dependent resistance， however， the genetic biodiversity of PRSV in Hainan is higher than other region in the world. To solve the PRSV problem in Hainan， we used the latest genomic editing technology CRISPR/FnCas9 assisted with Golden Gate vector system to construct 5 concatenated sgRNA （2 CP sgRNA，2 Nib sgRNAand1 HC-Pro sgRNA） on single vector， which can achieve the broad-spectrum PRSV resistance. In the later period， we can easily adjust or replace sgRNA according to the actual disease resistance， and deal with the complex problem of the papaya ring spot virus strain in Hainan. The vector has been sequenced and verified. The vector transiently expressed on leaves of papaya and showed a preliminary inhibitory effect on PRSV. This will lay a good foundation for obtaining broad spectrum resistance papaya varieties agatnst PRSV.

Key words papaya； CRISPR； papaya ringspot virus； broad spectrum disease resistance； genome editing

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.019

番木瓜（Carica papaya L.）是中國和世界上其他熱帶地區(qū)最重要的消費(fèi)和出口水果之一。番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）是番木瓜生產(chǎn)上最大的限制因素，不抗病品種幾乎絕產(chǎn)[1]。由于番木瓜本身缺少抗病種質(zhì)，除轉(zhuǎn)基因抗病育種外，目前尚無其它有效防治方法[2]。

在物理和化學(xué)防治措施效果不佳與抗性品種缺乏的情況下，現(xiàn)代生物技術(shù)方法被引入對(duì)PRSV的防治工作。1990年首例轉(zhuǎn)PRSV外殼蛋白（Coat protein， CP）基因番木瓜問世[3-4]。1998年夏威夷轉(zhuǎn)基因番木瓜“Rainbow”開始商業(yè)化應(yīng)用，這是轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水果上的首次應(yīng)用[5]。目前，被實(shí)際應(yīng)用的番木瓜抗病毒基因多數(shù)來自病毒本身的基因，如病毒的外殼蛋白基因（CP）、復(fù)制酶基因（Replicate，RP，Nib）、成分輔助蛋白酶基因（Helper component-proteinase， HC-Pro）[5-6]。PRSV存在地理株系，不同地區(qū)的病毒株系差異大，番木瓜轉(zhuǎn)基因育種研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)夏威夷或臺(tái)灣PRSV外殼蛋白基因的品種僅對(duì)夏威夷或臺(tái)灣的相近株系具有較好的抗性[4， 7]。近年來，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)海南的PRSV病毒株系的種類與分布在分子水平上進(jìn)行了研究，確認(rèn)了在海南分布3種不同類型的PRSV株系（HainanⅠ、HainanⅡ和HainanⅢ）[8]，海南PRSV具有極高的突變率，在育種中需綜合考慮以培育出廣譜抗病的轉(zhuǎn)基因品種[9]。

DNA組裝方法是生物技術(shù)的基本工具，目前已有多種方法克隆DNA目的片段。在傳統(tǒng)方法中，克隆構(gòu)建載體通常需要幾個(gè)步驟，相對(duì)繁瑣。近些年來，發(fā)展出了一套新的一步克隆法——Golden Gate，其中ⅡS型限制性核酸內(nèi)切酶有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)負(fù)責(zé)識(shí)別序列，另一個(gè)負(fù)責(zé)切割，非特異性地在識(shí)別位點(diǎn)下游進(jìn)行切割[10-11]。Golden Gate克隆法是在同一反應(yīng)體系中，利用ⅡS型限制性核酸內(nèi)切酶在識(shí)別位點(diǎn)之外切開DNA，產(chǎn)生含粘性末端的DNA片段，同時(shí)用連接酶將幾個(gè)DNA片段按照既定的順序連接，拼接成不含酶識(shí)別位點(diǎn)的DNA片段，使多個(gè)目的DNA片段按照設(shè)定的順序?qū)崿F(xiàn)“無縫”連接[12-13]。

本研究將編輯DNA雙鏈的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了改造，用FnCas9替換了Cas9的CRISPR/FnCas9系統(tǒng)可對(duì)RNA識(shí)別和切割。本研究對(duì)病毒不同株系和不同基因的保守區(qū)域進(jìn)行分析，并設(shè)計(jì)了針對(duì)目標(biāo)病毒不同基因的多個(gè)不同的gRNA，串聯(lián)到植物表達(dá)載體中，對(duì)不同株系的PRSV病毒進(jìn)行識(shí)別并切割其病毒RNA，達(dá)到廣譜抗PRSV的目的，使番木瓜植株獲得可遺傳抗性，為培育廣譜抗PRSV的番木瓜新品種奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 大腸桿菌DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。農(nóng)桿菌AGL1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京天恩澤基因科技有限公司。載體pMOD_A0101、pMOD_B2301、pMOD_C0000、pTRANS_220d由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)Dan Voytas實(shí)驗(yàn)室合作提供。載體pMOD_A0101-Fn骨架來自pMOD_A0101，用FnCa9替換其中的Cas9基因，替換的基因依據(jù)發(fā)表序列[14]由生工生物工程（上海）股份有限公司基因合成。瞬時(shí)表達(dá)所用PRSV病毒株系為本實(shí)驗(yàn)室保存在-80 ℃的HainanⅠ、HainanⅡ和Hainan Ⅲ，番木瓜幼苗為非轉(zhuǎn)基因品種臺(tái)農(nóng)二號(hào)。

1.1.2 酶類及主要生化試劑 限制性核酸內(nèi)切酶LguⅠ（SapⅠ）、Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）、AarⅠ購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；T7 DNA ligase購自New England Biolabs （Beijing） LTD；T4 DNA ligase購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR Master Mix購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；Plasmid DNA Mini KitⅠ和Gel Extraction Kit購自O(shè)mega Bio-Tek公司；植物總RNA提取試劑盒TransZolTM Plant和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript Reverse Transcriptase購自全式金公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物 如表1所示，根據(jù)海南PRSV不同株系保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)的sgRNA（小寫字母）和載體序列（大寫斜體字母），設(shè)計(jì)引物并加入SapⅠ、Esp3Ⅰ酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司廣州合成部合成。

1.2 方法

1.2.1 海南PRSV保守區(qū)域分析 在前期對(duì)海南PRSV株系鑒定分類的研究基礎(chǔ)上，針對(duì)目前NCBI上面已上傳的52條PRSV的3個(gè)關(guān)鍵基因（CP、Nib和HC-Pro）分別建立基因庫[8]。用DNAMAN Version 7通過比較關(guān)鍵功能蛋白的氨基酸序列及其DNA序列，對(duì)基因庫的同源性水平進(jìn)行比較，軟件參數(shù)參照Xiong等[15]。

1.2.2 sgRNA設(shè)計(jì) 分別依據(jù)3個(gè)基因庫不同的同源性水平確定的保守區(qū)序列，用軟件CasOT （http：//eendb.zfgenetics.org/casot/index.php）和sgRNAcas9 （http：//www.biootools.com/）設(shè)計(jì)識(shí)別PRSV的sgRNA，并分析其脫靶效益，最終確定5個(gè)sgRNA分別為>cp_r1：agcatccacagcttcattct；>cp_r2：acccagacaccagatatatc；>hcpro_r1：atgacacggaaacaagatta；>hcpro_r2：gtaattagcaaagaatcttt；>nib_r2：tcacaatagacccaaccatc。使用在線軟件Multi-gRNA Array Assembly-Primer Design and Map Construction（http：//cfans-pmorrell.oit.umn.edu/CRISPR_Multiplex/assembly.php），將sgRNA序列導(dǎo)入，選擇目標(biāo)載體、啟動(dòng)子系統(tǒng)、限制性核酸內(nèi)切酶、拼接系統(tǒng)，軟件將會(huì)自動(dòng)生成引物[16]。

1.2.3 PCR擴(kuò)增目的片段 配置50 μL的反應(yīng)體系，具體成分為：Plasmid DNA，0.5 μL；正反向引物各0.5 μL；2×PCR Master Mix，25 μL；Nuclease-free Water，23.5 μL。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)程序：98 ℃/1 min+30 個(gè)循環(huán)（98 ℃/10 s+60 ℃/15 s+72 ℃/15 s）；72 ℃/2 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切膠，用試劑盒回收目的條帶。

1.2.4 中間載體pMOD_B2301-PRSV-5sgRNA構(gòu)建 配置20 μL反應(yīng)體系，具體成分為：60 ng質(zhì)粒pMOD_B2301，25 ng PCR（PCR Reaction 1、PCR Reaction2、PCR Reaction3、PCR Reaction4、PCR Reaction5、PCR Reaction6）膠回收產(chǎn)物，2.5 U SapⅠ，5 U Esp3Ⅰ，3 U T7 DNA ligase，10 μL 2×T7 DNA ligas buffer，滅菌水加補(bǔ)足到20 μL。混勻后運(yùn)行PCR程序如下：10個(gè)循環(huán)（37 ℃/5 min+25 ℃/10 min）。取5μL反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃過夜培養(yǎng)，挑48個(gè)長勢良好的單克隆菌落，液體LB中37 ℃培養(yǎng)6 h后，做菌落PCR篩選陽性克隆。挑選3～5個(gè)陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司廣州測序部測序。測序結(jié)果用軟件DNAMAN和SnapGene比對(duì)，確定5個(gè)gRNA已按正確順序完整連入到pMOD_B2301-PRSV-5sgRNA。對(duì)測序驗(yàn)證正確的陽性單克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，保菌，并提取質(zhì)粒DNA，留作下一步實(shí)驗(yàn)之用。

1.2.5 組裝CRISPR/FnCas9植物表達(dá)載體 配置20 μL反應(yīng)體系，具體成分為：質(zhì)粒100 ng pTRANS_220 d，120 ng質(zhì)粒pMOD_A0101-Fn，150 ng質(zhì)粒pMOD_B2301-PRSV-5sgRNA，150 ng質(zhì)粒pMOD_C0000，0.4 U AarⅠoligonucleotide，1 U AarⅠ，5 U T4 DNA ligase，2 μL 10×T4 DNA ligas buffer，用滅菌水補(bǔ)足20 μL。PCR程序如下：37 ℃/5 min+16 ℃/10 min，10個(gè)循環(huán)；37 ℃/15 min，80 ℃/5 min。將20 μL反應(yīng)產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取48個(gè)長勢良好的單菌落，液體LB中37 ℃培養(yǎng)6 h后做菌落PCR篩選陽性克隆。挑選3～5個(gè)陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

3 討論

規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats， CRISPR）是大多數(shù)細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種獲得性免疫方式，在其基礎(chǔ)上改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的sgRNA部分具有與Cas9結(jié)合并定向識(shí)別DNA序列的功能，而Cas9則具有核酸內(nèi)切酶的活性。2015年中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究團(tuán)隊(duì)在Nature Plants上發(fā)表利用CRISPR/Cas9類似免疫系統(tǒng)成功對(duì)抗植物DNA病毒的研究[14]。2015年《美國科學(xué)院院刊》PAN雜志發(fā)表一項(xiàng)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)抗真核細(xì)胞RNA病毒的新研究，用一種來自弗朗西絲菌的Cas9酶（FnCas9）來識(shí)別剪切丙型肝炎病毒的基因組RNA，阻止了這一病原體在人類細(xì)胞中的復(fù)制[19]。已經(jīng)有改造CRISPR/Cas9系統(tǒng)在煙草和擬南芥中實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA病毒進(jìn)行編輯的報(bào)道，該研究在植物中表達(dá)FnCas9和能靶標(biāo)黃瓜花葉病毒或煙草花葉病病毒的sgRNA，結(jié)果顯示病毒感染癥狀明顯減輕、病毒RNA的積累減少，進(jìn)一步研究表明該抗病性狀可穩(wěn)定遺傳到下一代[20]。

目前商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因抗病毒番木瓜主要采用RNAi技術(shù)，但該技術(shù)在廣譜抗病毒方面優(yōu)勢不足。為了提高轉(zhuǎn)基因番木瓜的廣譜抗性，通過RNAi發(fā)夾載體與多個(gè)株系共同保守序列構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化，可提高RNAi干擾效率。但受發(fā)夾載體構(gòu)建技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)入的外源病毒片段在200～600 bp之間才有較好的效率，RNAi干擾技術(shù)不能一次轉(zhuǎn)入太多株系的基因片段，這制約了干擾病毒基因的范圍，達(dá)不到廣譜抗病效果。因此，簡單、靈活、高效的廣譜抗RNA病毒株系的新技術(shù)有待進(jìn)一步開發(fā)。基于CRISPR/FnCas9系統(tǒng)，根據(jù)海南番木瓜病毒不同株系關(guān)鍵基因設(shè)計(jì)短RNA引導(dǎo)序列（約20 bp），組成串聯(lián)sgRNA（<100 bp），與FnCas9一起轉(zhuǎn)化番木瓜，可能取得更好的廣譜抗病效果。因此在CRISPR/FnCas9植物表達(dá)載體上增加一個(gè)串聯(lián)sgRNA僅增加不到100 bp的核苷酸序列，即使增加10個(gè)病毒株系的特異引導(dǎo)序列，也不到1 000 bp的核苷酸序列，對(duì)植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化效率不會(huì)有太大影響，此外RNA引導(dǎo)序列需要的核苷酸數(shù)量很少，與RNAi載體構(gòu)建比較，在載體設(shè)計(jì)上更簡單、靈活、高效、經(jīng)濟(jì)、可操作性強(qiáng)。

本研究獲得的工程菌株在番木瓜葉片上的瞬時(shí)表達(dá)中，農(nóng)桿菌只能侵入葉片局部位置，故載體只能在葉片局部細(xì)胞中工作。PRSV在番木瓜上屬系統(tǒng)性發(fā)病，在葉片的葉尖部位進(jìn)行PRSV接種后，病毒順著葉片擴(kuò)散到整個(gè)植株。病毒在經(jīng)過農(nóng)桿菌注射的葉片基部時(shí)受到抑制，但帶有載體的細(xì)胞數(shù)目有限，不能完全阻斷病毒的擴(kuò)散。本研究結(jié)果表明，注射工程菌株僅減緩了病毒的擴(kuò)散和復(fù)制。想要真正達(dá)到完全抗病毒的效果需要進(jìn)行番木瓜愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因番木瓜株系。

本研究將基因編輯技術(shù)應(yīng)用于番木瓜抗病育種，可能起到理想的抗病效果。將現(xiàn)有編輯DNA雙鏈的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行改造，用FnCas9替換Cas9，改造后該系統(tǒng)有望可識(shí)別并切割RNA。同時(shí)依據(jù)對(duì)PRSV不同株系和不同基因的保守區(qū)域的分析，設(shè)計(jì)多個(gè)不同的gRNA，串聯(lián)到植物表達(dá)載體pCRISPR-PRSV-5gRNA-FnCas9中，可對(duì)不同株系的病毒進(jìn)行識(shí)別并切割其基因組RNA，真正實(shí)現(xiàn)廣譜抗PRSV的目的。本研究已經(jīng)對(duì)載體進(jìn)行了測序比對(duì)驗(yàn)證，同時(shí)在番木瓜上進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證的初步證明，該載體能夠抑制PRSV在番木瓜上的積累。目前正在進(jìn)行番木瓜的遺傳轉(zhuǎn)化，以期獲得廣譜抗PRSV的轉(zhuǎn)基因番木瓜株系，為進(jìn)一步培育廣譜抗PRSV的番木瓜新品種奠定基礎(chǔ)。

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