抑制尖孢鐮刀菌人工肽適體的篩選和鑒定

黃君君　馬香　唐鴻倩　劉柱　唐燕瓊

摘 要 香蕉枯萎病嚴重危害香蕉產業的發展。本研究從肽適體文庫中篩選獲得對香蕉枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌有抑制作用的人工肽適體SNP-D4。通過構建人工肽適體體外重組表達載體，獲得SNP-D4體外重組蛋白。結果表明，通過抑菌活性檢測表達人工肽適體SNP-D4的大腸桿菌全蛋白提取液，能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發，使其萌發率降低至19.60%。本研究篩選得到的人工肽適體SNP-D4可應用于研發環境友好型特異抗真菌生物制劑，為香蕉枯萎病防治提供新的技術手段。

關鍵詞 香蕉枯萎??；肽適體；尖孢鐮刀菌；載體構建；抑菌活性

中圖分類號 S46 文獻標識碼 A

Abstract Banana fusarium wilt was a serious disease which causes great damages to banana-developing industries. Fusarium oxysporum f. sp. cubense FOC4 was considered as the essential pathogen. In this study， the artificial pepaptamer SNP-D4 was identified from our created pepaptamers library for the inhibition of Fusarium oxysporum f. sp. cubense FOC4. The recombinant expression vector SNP-D4 was constructed and expressed. The results of antifungal activity test revealed that the total protein extract of Escherichia coli containing SNP-D4 expression could specifically inhibite up to 19.60% of the germination rate for F. oxysporum FOC4. Collectively， our present study implied that the artificial pepaptamer SNP-D4 could be applied to develop environment-friendly biological agents for the control of specific fungal disease， offering a new technique for the prevention and control of banana fusarium wilt.

Key words banana fusarium wilt；pepaptamers；Fusarium oxysporum；vector construction；antifungal activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.022

香蕉枯萎病是一種侵染香蕉植株維管束的真菌引起的土傳病。由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense，FOC）真菌侵染香蕉根部引起的土傳維管束病害[1]，難以根治，對香蕉產業造成了毀滅性危害[2]。其中尖孢鐮刀菌4號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，FOC4）的毒力和致病能力都遠超其他生理小種[3]，且具有極強的抗逆性，可在土壤中存活20 a之久[4]，會常造成大面積毀園[5]，是威脅我國香蕉產業的主要因素之一。尖孢鐮刀菌以菌絲體、大型分生孢子和小型分生孢子的形式附著于根系表皮細胞[6]，通過分泌一系列毒素破壞根系的膜結構，造成植株代謝紊亂[7]，感染后期可直接侵染植株維管束，導致維管束木質化[8]。目前，對香蕉枯萎病仍缺乏有效的防護措施[9]，相關的防治研究主要集中在化學農藥篩選方面，也有部分研究者尋找有效的生物防治手段[10]。

肽適體（peptide aptamer或pepaptamers）是一種篩選自人工合成的隨機氨基酸文庫，可高特異性、高親和力結合靶標蛋白質的短肽[11]。其主要結構包括一段結構穩定的支架蛋白（scaffold protein）和兩端固定在支架蛋白上的可變肽段[12]（圖1），其中的可變肽段通常由8～20個氨基酸組成，具有識別和結合特異靶蛋白的能力。人工肽適體的篩選和應用是目前生物抗菌劑研發的熱點，其具有以下3個方面優勢：第一，靶標特異性極高，可以區分同一蛋白家族的不同成員；其二，分子量較抗體小，但對靶蛋白的識別與結合能力與抗體相當；其三，體內可折疊為穩定的三級構象，與一般的游離氨基酸相比更有利于保持較高生物學活性[13]。

目前肽適體在腫瘤治療[14]、食品安全[15]、植物生物技術[16]等方面中的巨大潛力已被發現[17]。在植物病害防治中的應用主要是作為植物病毒的干擾劑，通過阻斷病毒感染周期的特定環節阻礙病毒感染植物[18]。Rudolph等[19]以番茄斑萎病毒的核衣殼為靶標篩選到肽適體，轉化煙草Nicotiana benthamiana中，使其同時對番茄斑萎病毒 （TSWV）、番茄退綠葉斑病毒（TCSV）， 花生環斑病毒 （GRSV）， 菊花莖部壞疽病毒（CSNV）等產生抗性。

利用肽適體防治植物真菌病害的研究還有待開拓。本實驗室前期以改造的葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal Nuclease，SNase，下文簡稱SN）為支架蛋白，將可編碼16個隨機氨基酸的文庫DNA插入SNase中，獲得系列質粒pTRG-SNase-peptide（簡稱pTRG-SNP，后文中SNase-peptide均縮寫為SNP），構成一個庫容量約為1.5～2.0×107 的肽適體文庫，同時構建了僅表達肽適體支架蛋白的pTRG-SN質

粒[20]。本研究通過尖孢鐮刀菌孢子萌發試驗，直接篩選肽適體文庫，獲得能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌的人工肽適體SNP-D4，通過體外表達SNP-D4并進行抑菌活性檢測，證明人工肽適體SNP-D4能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發。本研究的結果為研發抗尖孢鐮刀菌的生物抗菌劑提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和病原菌 供試菌株：大腸桿菌reporter，大腸桿菌BL21（DE3）。病原菌：尖孢鐮刀菌熱帶四號小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，FOC4）。以上菌株均由本實驗室保存。

1.1.2 培養基 LB液體培養基：胰蛋白胨1.0 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水100 mL， pH 7.0，121 ℃滅菌20 min； LB固體培養基：在LB液體培養基基礎上添加瓊脂糖1.5 g即成，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；0.3%營養液：葡萄糖0.3 g，酵母提取物0.3 g，胰蛋白胨0.03 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 肽適體文庫的篩選 將肽適體文庫轉入制備好的大腸桿菌reporter感受態細胞中，分離單菌落并使用特異性引物F1和R1驗證，之后分別保存菌種。將保存的菌株分別接種至5 mL含四環素（Tet，終濃度50 μg/mL）的LB液體培養基中，37 ℃，150 r/min搖床過夜；按1%接種量將菌液接種至20 mL的LB液體培養基（含Tet，終濃度50 μg/mL）中，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，簡稱IPTG，終濃度100 μmol/L），15 ℃，150 r/min誘導過夜。收集菌體，用4 mL 50 mmol/L磷酸緩沖溶液（Phosphate Buffered Saline，簡稱PBS）懸浮，進行超聲破碎。超聲5 s，間隙6 s，功率35%，共20 min。收集上清，即細菌全蛋白提取液。將10 μL轉入pTRG-SNP載體的reporter菌株細菌全蛋白提取液、10 μL 4×106個/mL尖孢鐮刀菌孢子懸液、10 μL 0.3%營養液混勻，同時以PBS處理作為空白對照，轉入pTRG-SN載體的reporter菌株的細菌全蛋白提取液作為陰性對照，0.3%惡霉靈處理作為陽性對照，不同處理組均在28 ℃培養箱培養12 h后于光學顯微鏡40×物鏡下觀察孢子萌發情況。

1.2.2 功能性肽適體的鑒定 將篩選到的菌株劃線活化，37 ℃培養過夜。每種菌株挑選3個單菌落，再次劃線活化，37 ℃培養過夜；挑單菌落于5 mL LB液體培養基（含Tet，終濃度50 μg/mL）中，37 ℃ 250 r/min培養過夜；提取質粒并測序。

1.2.3 重組載體構建 利用目的片段特異性引物F2/R2擴增肽適體SNP-D4以及肽適體支架蛋白SN核苷酸序列，利用PCR產物回收試劑盒回收目的片段。將上述目的片段及pET28a空載體分別用限制性內切酶Nco I和Xho I進行雙酶切，之后回收酶切產物。將上述酶切產物用T4連接酶連接，得到連接產物。

1.2.4 重組質粒轉化和陽性克隆子鑒定 將連接產物通過熱激法轉入大腸桿菌BL21感受態細胞，之后涂布到含卡那霉素（Kan，終濃度50 μg/mL）的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜。之后挑取陽性克隆子，分別使用載體特異性引物F2/R2和目的片段特異性引物F3/R3進行PCR驗證。最后將經驗證的陽性克隆提取質粒并測序。

1.2.5 重組蛋白的表達 將構建重組載體陽性克隆接種至5 mL LB液體培養基（含Kan，終濃度50 μg/mL），37 ℃，150 r/min搖床過夜；將活化的菌液按1%接種量接種至50 mL的LB液體培養基（含Kan，終濃度50 μg/mL）中；加入IPTG （終濃度100 μmol/L），15 ℃，150 r/min誘導過夜。

1.2.6 抑菌試驗 通過上述方法誘導重組菌株大量表達外源蛋白SN和SNP-D4之后，之后采用超聲波破碎獲得細菌全蛋白提取液，采用BCA法（使用GENEray公司的BCA法蛋白定量試劑盒）測定全蛋白濃度。將細菌全蛋白提取液蛋白濃度均稀釋至30 mg/mL，將10 μL細菌全蛋白提取液、10 μL 4×106個/mL尖孢鐮刀菌孢子懸液、10 μL 0.3%營養液混勻，同時以PBS處理組為空白對照，3組處理均在28 ℃培養箱培養12 h后，在光學顯微鏡40×物鏡下觀察孢子萌發情況，每組取3個不同的視野，觀察并統計萌發率。萌發率=萌發孢子數/總孢子數×100%。重復3次取平均值。

1.3 數據分析

試驗所得數據采用SAS 9.0統計學分析軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 肽適體文庫篩選

從肽適體文庫中分離鑒定得到32個肽適體單克隆。初步抑菌實驗結果顯示，在32個肽適體單克隆中，發現5種肽適體對尖孢鐮刀菌孢子具有抑制作用，其中SNP-D4效果最佳。從圖2中可看出，在相同處理時間下，PBS處理組與轉入pTRG-SN載體的reporter菌株的細菌全蛋白提取液處理組的孢子幾乎全部萌發，形成明顯的菌絲體，出現菌絲結團現象，說明PBS與轉入pTRG-SN載體的reporter菌株的細菌全蛋白提取液對孢子的萌發不具抑制作用，而SNP-D4處理組的孢子大多數未萌發，少數萌發的孢子的菌絲長度明顯短于陰性對照組，并未出現菌絲結團現象，其抑制效果幾乎與0.3%惡霉靈處理組相當，說明SNP-D4本身對孢子的萌發具有一定抑制作用。

紅色圓圈標記的為未萌發的孢子，紅色箭頭標記的為萌發受到抑制的孢子。

為了確定具有孢子萌發抑制活性的SNP-D4的序列信息，提取表達SNP-D4的質粒并測序，得到SNP-D4全長576 bp，編碼191個氨基酸，整體蛋白分子量大小為21 ku（圖3）。其編碼的可變肽段序列為共16個氨基酸（圖3中紅色邊框標記的部分）。

2.2 人工肽適體SNP-D4原核表達載體構建

通過菌落PCR驗證陽性轉化子擴增結果如圖4所示，表達SN的候選菌落使用2種引物擴增分別獲得724、537 bp的單一條帶，表達SNP-D4的候選菌落使用2種引物擴增分別獲得769、582 bp的單一條帶，而且PCR產物單一，無其他雜帶或污染，符合預期。提取重組質粒并測序，將測序結果與SN和SNP-D4的核酸序列進行比對，序列一致，表明已經成功構建可外源表達SN和SNP-D4的重組載體。

2.3 外源表達人工肽適體SNP-D4抑菌效果評估

通過抑菌實驗驗證外源表達人工肽適體SNP-D4的抑菌效果，孢子萌發率統計結果見圖5。從圖5可見，用表達人工肽適體SNP-D4的細菌全蛋白提取液處理時，尖孢鐮刀菌孢子萌發率僅為19.60%，與之相比，用PBS處理時的萌發率為78.33%，二者之間差異極顯著（p<0.01），用肽適體支架蛋白SN的細菌全蛋白提取液處理時，孢子萌發率為72.10%，與空白對照PBS并未有顯著差異，表明本研究所篩選的人工肽適體SNP-D4能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發。另外肽適體支架蛋白SN對尖孢鐮刀菌的孢子萌發沒有顯著影響，說明發揮抑菌功能的是肽適體SNP-D4的可變肽段部分。

3 討論

香蕉枯萎病是香蕉產業的重要真菌病害之一，長期以來都引起人們的高度重視。目前可以用于防治香蕉枯萎病的化學藥劑包括惡霉靈、多菌靈[21]等。Borges 等[22]在枯萎病菌侵染前用甲萘醌亞硫酸氫鈉（一種維生素K）處理香蕉苗，發現處理后的香蕉苗中，植物抗毒素快速且大量合成，能夠延緩枯萎病癥狀的發生。但是，化學藥劑有效成分難以分離和鑒定，而且通常價格昂貴，并且化學藥劑的大量使用存在污染環境等問題。生物防治方面的研究主要包括篩選拮抗菌[23]、農作物間作及輪作[24]等，其中拮抗菌是一種非常重要的防治手段。李載淵等[25]通過生長對峙實驗從五指山原始林區采集的土樣中選擇性分離得到702 株稀有放線菌，最終經過復篩，獲得一株對尖孢鐮刀菌具有高活性的拮抗菌210-1-61。但是，拮抗菌也存在抑菌機理不清楚，以及破壞土壤微生物生態平衡等問題。因此，為了有效防止尖孢鐮刀菌引起的香蕉枯萎病，仍需要探索新型、環保的有效技術手段。

肽適體作為一種新型生物材料，被廣泛應用于藥物研發方面，而其在生物農藥方面主要是用作抗病毒制劑[26]。針對特定的生理功能分析，如病毒DNA復制復合體組裝等[27]，是通過篩選特定病毒靶標具有高特異性的肽適體，達到干擾病毒功能的作用。本研究首次嘗試將肽適體應用于抑制尖孢鐮刀菌，成功篩選到能夠特異性抑制香蕉枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌的肽適體，并獲得其外源表達蛋白。研究發現，含有外源表達人工肽適體SNP-D4的細菌全蛋白提取液可將FOC4的孢子萌發率降低至19.60%，而人工肽適體的支架蛋白并未對孢子萌發率有顯著影響（處理后萌發率為72.10%），說明發揮抑菌功能的為人工肽適體SNP-D4可變肽段部分的16個氨基酸。綜上所述，人工肽適體SNP-D4能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌孢子萌發，具有作為一種新型生物農藥的潛力。

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