瓜實蠅氣味結合蛋白基因的克隆及表達譜分析

張亞楠 龔治 牛黎明 符悅冠

摘 要 在氣味識別過程中，氣味結合蛋白（OBPs）對昆蟲的行為反應有重要作用。通過轉錄組庫和NCBI篩選獲得瓜實蠅[Bactrocera cucurbitae（Coquillett）]OBPs基因序列，進而通過RT-PCR、克隆等方法獲取cDNA全長序列，命名為BcucOBP19。結果表明：BcucOBP19基因開放閱讀框全長471 bp，編碼157個氨基酸，分子量17.5 ku，等電點5.14，具有昆蟲OBPs典型的6個保守半胱氨酸位點。BcucOBP19在瓜實蠅各部位均有表達，以15日齡的雌蟲觸角中表達量最高，在頭、腹、翅和前足中表達量較低，且沒有顯著性差異。

關鍵詞 瓜實蠅；氣味結合蛋白；基因克隆；組織表達

中圖分類號 S763.41 文獻標識碼 A

Abstract In the process of odor recognition， odorant binding proteins play an important role in the behavioral response to insects. The full-length cDNA sequence of Bactrocera cucurbitae （Coquillett） was identified by RT-PCR and cloned through transcriptome library and NCBI， which was named as BcucOBP19. The sequencing results showed that BcucOBP19 contained a 471 bp open reading frame encoding a 157-amino-acid residue peptide， The predicted molecular weight and isoelectric point was 17.5 ku and 5.14， respectively. The mature protein BcucOBP19 includeed six typical conservative cysteine residues， which is the hallmark of insect OBPs. BcucOBP19 was expressed in all parts of melon fruit fly. The expression of BcucOBP19 was the highest in the tentacles of 15 day-old females. The expressions were very low in the head， abdomen， wings and forefoot， which did not reach the significant level.

Key words Bactrocera cucuribitae； odorant binding protein； gene cloning； tissue expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.019

瓜實蠅[Bactrocera cucurbitae（Coquillett）]隸屬于雙翅目（Diptera）實蠅科（Tephritidae）果實蠅屬（Bactrocera macquart），是一種重要的檢疫害蟲[1]。瓜實蠅起源于印度[2]，現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[3]，主要為害葫蘆科植物，可為害南瓜、苦瓜、絲瓜等100多種蔬菜和水果[4]。

氣味感知涉及多個基因家族，包括氣味結合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）、化學感應蛋白（CSPs）和氣味劑受體（ORs）等[5]。昆蟲OBPs是由嗅覺感器內部支持細胞分泌的浸潤于感器淋巴液中并分布在感覺神經(jīng)元軸突周圍的一類水溶性酸性蛋白[6]，OBPs在昆蟲氣味分子和信息素識別、嗅覺信號傳導運輸中具有重要作用[7]。昆蟲OBPs分子量一般為15～20 ku，由120～150個氨基酸組成，其典型特征是在其二級序列中存在6個保守的半胱氨酸（Cys）殘基以形成3對二硫鍵[8]，結構緊湊，主要由K-螺旋域組成[9]。根據(jù)識別的氣味分子不同，OBPs又分為性信息素結合蛋白（pheromone binding protein，PBP）和普通氣味結合蛋白（general odorant binding protein，GOBP）[10]，前者與昆蟲感受性信息素有關，后者用于取食、信息交流等基礎活動。

瓜實蠅雌蟲和雄蟲對一些氣味的趨向反應不同，例如誘蠅酮只對雄蟲有吸引作用[11]，雌蟲對成熟瓜果的氣味趨向性更強[4]。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲對氣味的趨向行為與OBPs有關[12]，而OBPs基因只有少數(shù)被發(fā)現(xiàn)和克隆表達，這類基因的尋找是一大難點。在已經(jīng)進行基因組全序列測定的昆蟲中，利用NCBI和轉錄組庫尋找近源種的OBPs基因序列，結合生物信息學以及熒光定量RT-PCR等生物化學和分子生物學技術手段[13]，在昆蟲中鑒定OBPs基因。為了探究瓜實蠅OBPs在雌雄個體間表達是否存在差異，通過瓜實蠅轉錄組庫和NCBI搜尋氣味基因[14]，對瓜實蠅OBPs基因的一個 cDNA全長序列進行克隆和分析，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定瓜實蠅OBPs基因表達量。了解瓜實蠅OBPs的基本特征，有助于開發(fā)環(huán)境友好的新型昆蟲行為干擾劑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲為實驗室飼養(yǎng)的瓜實蠅。飼養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度60%～70%，光周期14L：10D。待其羽化后，收集不同日齡的雌雄瓜實蠅，活體采集各個部位。具體方法為：用角膜剪快速剪去各部位，置于在液氮環(huán)境中的1.5 mL離心管內。瓜實蠅8日齡開始逐漸性成熟，15日齡進入產(chǎn)卵高峰期。實驗中分別收集2、5、8、15、30日齡雌性和雄性瓜實蠅的觸角、頭部（去觸角）、腹部、翅膀、前足共50個樣本，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：TransZol Up Plus Kit、TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart? Tip Green qPCR SuperMix、pEASY?-T1 Cloning Kit、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等試劑盒來自北京全式金生物科技有限公司，Ampicillin、三氯甲烷、瓊脂糖、無水乙醇、Taq DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker、DNA loading buffer等試劑均購自海南青峰科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 采用TransZol Up Plus Kit推薦的方法提取RNA。提取的總RNA經(jīng)微量紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳（圖1）檢測濃度和質量合格后，用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉錄cDNA。反應體系為20 ?L，包括10 ?L 2×TS Reaction Mix、1 ?L Anchored Oligo（dT）18 Primer（0.5 ?g/?L）、1 ?L gDNA Remover、1 ?L TransScript? RT/RI Enzyme Mix、50 ng～5 ?g RNA，Rnase-free Water 補齊至20 ?L。反應條件：42 ℃ 30min，85 ℃ 5 s，4 ℃ ∞。cDNA產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計與合成 利用轉錄組庫設計得到克隆全長cDNA序列的引物和熒光定量PCR的特異性引物，并用已篩選出最穩(wěn)定的RPL-60作為熒光定量PCR的內參引物（表1）。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 瓜實蠅OBP19的克隆 以30日齡雌蟲的cDNA第一鏈為模板，用克隆引物進行梯度PCR，電泳檢測出最適退火溫度。PCR反體系為20 ?L，包括10 ?L 2×EcoTaq PCR SuperMix ，上下游引物各1 μL，cDNA1 ?L，加ddH2O至20 ?L。PCR擴增程序：94 ℃，3 min；94 ℃ 45 s，退火溫度（51、54、57 ℃） 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃，10 min，；4 ℃，∞。將電泳鑒定無誤的PCR產(chǎn)物連接至T1載體，轉化入Trans1-T1感受態(tài)細胞，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個白色菌落溶于無菌水，PCR鑒定陽性克隆無誤后（圖2），在溶于無菌水的菌落中加入700 ?L LB液體培養(yǎng)基200 r/min 37 ℃培養(yǎng)8～10 h，菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進行序列測定。蛋白質理化性質預測使用蛋白質組學在線軟件 Expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，信號肽預測使用在線 軟 件 Signal P 3.0（http： //www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/）分析[14]。

1.2.4 瓜實蠅OBP19的時空表達 用試劑盒TransStart? Tip Green qPCR SuperMix推薦的方法進行熒光定量。反應采用熒光染料SYBR Green在實時熒光定量PCR儀（QuantStudio 6 Flex）中用96孔板進行。反應體系共20 ?L，包括cDNA 1 ?L，引物F&R各0.4 ?L，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 ?L，Passive Peference Dye（50×） 0.4 ?L，ddH2O 7.8 ?L。反應中ddH2O代替cDNA為陰性對照。反應采用兩步法，具體程序設置如下：Step 1：94 ℃ 3 min；Step 2：94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 cycle；Step 3：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。信息采集步驟在Step 2 stage 2，60 ℃時信息采集。每個樣本的內參組和OBP引物組分別重復3次，用無菌水代替cDNA做空白對照。反應結束后根據(jù)CT值用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。

使用SPSS19.0軟件對不同日齡瓜實蠅的不同部位RNA相對表達量進行單因素方差分析、LSD檢驗和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 瓜實蠅OBP19基因克隆及序列分析

以瓜實蠅30日齡的雌蟲為模板，以CL4828.aF和 CL4828.aR為引物，梯度PCR后將產(chǎn)物連接入T1載體克隆測序得到532 bp的DNA序列，通過DNAMAN軟件比對得到BcucOBP19基因開放閱讀框全長471 bp，編碼157個氨基酸（圖3）。BcucOBP19蛋白序列具有6個保守的半胱氨酸位點，等電點為5.14，分子量大小為17.5 ku，不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）為48.39，說明該蛋白質不穩(wěn)定。脂肪指數(shù)（aliphatic index）為96.94，親和性（GRAVY）的平均水平為-0.152，說明其為親水蛋白質，信號肽的位置在5端1～26位氨基酸中。

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）中尋找相似序列，用DNAMAN進行二級結構預測及蛋白序列比對（圖4），瓜實蠅BcucOBP19與南瓜實蠅（Zeugodacus tau GOBP19d-like）的氨基酸序列一致性高達94%，而與桔小實蠅（Bactrocera dorsalis OBP19d）和模式生物果蠅（Drosophila melanogaster OBP19d）的氨基酸序列一致性分別為73%和24%。實蠅科昆蟲的蛋白序列相似性很高，說明實蠅科OBP19可能在結構和功能上相同。

2.2 二級結構和三級結構預測分析

將得到的蛋白序列輸入網(wǎng)站進行分析，用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？page=npsa_sopm.html進行蛋白質的二級結構預測，跨膜結構分析如圖5所示：在氨基酸序列中，α螺旋有85個氨基酸，占54.14%；β轉角有10個氨基酸，占6.37%；無規(guī)線圈有36個氨基酸，占22.93%；延長線有26個氨基酸，占16.56%；不存在β折疊、Pi螺旋等其他狀態(tài)。通過預測，跨膜結構在6～24位氨基酸中，TM-螺旋長度為17～33。

蛋白質三級結構輸入SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分析，結果如圖6所示，其主要結構為6個α螺旋，無規(guī)線圈、延長線和β轉角少量存在。

2.3 聚類分析

把得到的BcucOBP19蛋白序列輸入NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）blast程序進行同源性比對，相似序列包括實蠅科的南瓜實蠅、桔小實蠅、地中海實蠅、南美按實蠅、西印度按實蠅，以及果蠅科黑腹果蠅、非洲果蠅、中南美果蠅、西非果蠅的OBP19序列。用MEGA6.06軟件經(jīng)1 000次置信度構建系統(tǒng)進化樹。從圖7中可以看出，進化樹分為兩支：實蠅科聚為一支（Group1），果蠅科聚為一支（Group2）。瓜實蠅和南瓜實蠅的OBPs序列最為相近，其次是桔小實蠅。瓜實蠅與果蠅科昆蟲的OBP19距離較遠，這與昆蟲形態(tài)分類識別結果一致。

2.4 BcucOBP19表達譜分析

以2 d瓜實蠅雄蟲觸角中的表達量為對照，分別對2、5、8、15、30 d雌雄蟲不同部位（觸角、頭、腹、翅、前足）進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析（圖8）。研究發(fā)現(xiàn)，BcucOBP19基因在瓜實蠅各部位均有表達：觸角中的表達量最高，前足中的表達量最低。在所有表達量中，15 d雌蟲的觸角表達量出現(xiàn)高峰，之后恢復到穩(wěn)定表達水平，其余各部位表達量沒有顯著性差異。

3 討論

昆蟲OBPs識別和結合外界氣味分子是昆蟲感受外界氣味分子的第一步生化反應，對昆蟲與外界進行信息交流具有重要意義[8]。本研究克隆了瓜實蠅的OBP19基因并獲得其cDNA序列，結果表明BcucOBP19基因具有實蠅科昆蟲OBP19序列的共同特征，即多肽鏈長157個氨基酸，相對分子質量約為17.5 ku，信號肽的位置1～26位氨基酸，編碼親水性不穩(wěn)定蛋白，序列中有6個保守的半胱氨酸位點，具有昆蟲OBPs的典型特征[15-16]。為進一步研究瓜實蠅的嗅覺功能提供了理論基礎。

昆蟲的OBPs主要在觸角中表達，研究發(fā)現(xiàn)，不同日齡、不同組織表達譜中，BcucOBP19基因在瓜實蠅頭、腹、翅和前足都有少量表達，觸角中比其他部位總體表達量要高。15日齡的雌蟲觸角中出現(xiàn)大量表達，推測BcucOBP19基因在雌蟲性成熟發(fā)育、尋找寄主植物和產(chǎn)卵中擔任氣味識別的重要作用，BcucOBP19編碼的OBPs可能作為氣味劑和信息素的增溶劑或載體。NCBI上傳的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，很多昆蟲都有OBP19基因，例如桔小實蠅的BdorOBP19基因在雌性觸角中大量表達，在定位寄主植物和產(chǎn)卵過程中起重要作用[17]。關于BcucOBP19基因編碼的蛋白質認識不是很透徹，需要進行進一步研究。

了解昆蟲的OBPs的表達情況，可以作為分子靶標對昆蟲進行行為調控。后續(xù)可通過RNAi、基因敲除、基因沉默等方法檢測瓜實蠅在處理后表達量和行為上的變化，還可以用觸角電位儀檢測各種水果揮發(fā)氣味與BcucOBP19的結合程度，研究該基因的功能及化學感應程度，從基因層面切斷嗅覺識別途徑和昆蟲氣味引誘防治害蟲，從而研制環(huán)境友好的新型害蟲行為調節(jié)劑。

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