海南臺農芒采后果實炭疽病病原鑒定

陳亭妤 李聰 周國英 李河

摘 要 刺盤孢屬（Colletotrichum）真菌是芒果的重要病原菌。本研究采用形態和分子生物學鑒定了海南省臺農芒果實采收后炭疽病的病原菌。從臺農芒發病果實上總共分離純化獲得38株刺盤孢屬真菌。基于形態學特征和多基因序列（核糖體轉錄間隔區、鈣調蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶、谷氨酰胺合成酶、肌動蛋白、微管蛋白），確定引起臺農芒采后炭疽病的病原為暹羅炭疽菌（C. siamense）、亞洲炭疽菌（C. asianum）和果生炭疽菌（C. fructicola）。其中果生炭疽菌是我國芒果炭疽病原的首次報道。

關鍵詞 芒果；炭疽病；刺盤孢屬真菌；多基因系統發育

中圖分類號 S31 文獻標識碼 A

Abstract Colletotrichum species are the most important and widespread form of decay affecting mango fruit. In this study， Colletotrichum species associated with fruit anthracnose isolated from TaiNong mango in China were subject to molecular and morphological analyses. 38 strains were isolated from TaiNong mango， and identified based on morphologic characteristics and multi-locus （internal transcribed spacer ITS， calmodulin CAL， actin ACT， glutamine synthetase GS， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GD， β-tubulin TUB） phylogeny analysis. The multi-locus sequence analysis， together with a critical examination of the morphologic characters， revealed three previously described species （C. asianum， C. fructicola and C. siamense）. Only C. siamense and C. asianum have previously been reported from mango， while C. fructicola represent the first report associated with the mango fruits in China.

Keywords mango； anthracnose； Colletotrichum species； multi-locus phylogeny

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.020

臺農芒果實營養豐富，甜度極高，核小皮薄肉厚，果肉細致無纖維，主要分布在廣西、廣東和海南等華南廣大地區。炭疽病是芒果的第一大病害，特別是芒果果實采收后抗病性降低，可利用的營養物質增加，炭疽病原菌導致果實在田間或儲運中腐爛，有時病果率達60%以上，病果品質下降，每年造成的經濟損失高達8 000萬元以上，嚴重威脅著芒果產業的健康發展[1-4]。

刺盤孢屬（Colletotrichum）真菌的大多數相似種無法通過形態學特征來進行區分，目前國內外對炭疽病病原菌的研究主要采用形態學特征結合多基因序列分析鑒定。Weir等[5]在形態學基礎上結合多基因系統發育學方法在膠孢炭疽菌復合群（C. gloeosporioides complex）下確定了22個合格種和1個亞種，包括已經發現的合格種13個、描述新種10個。符丹丹[6]報道中國蘋果炭疽病的病原有7種，分別是C. aenigma、C. alienum、C. fructicola、C. gloeosporioides、C. nymphaeae、C. siamense和C. orientalis。王玉春等[7]報道的中國主要茶區茶樹炭疽菌有3種，分別是C. camelliae、C. fructicola和C. siamense。Lima等[8]采用6個基因位點系列（rDNA-ITS、ACT、GS、CAL、TUB-2和GAPDH），對巴西東北部的芒果炭疽病病原菌進行了研究，發現有5種刺盤孢屬真菌能引起芒果炭疽病。我國報道的芒果炭疽病病原菌主要有3種：C. gloesporioides、C. acutatum和C. siamense [9-14]。海南臺農芒采后炭疽病原菌尚無相關報道。本研究基于形態學特征，結合多基因分子系統發育分析及致病性測定，鑒定海南臺農芒果實采收后炭疽病病原菌種類，為進一步研究該病的發生規律、防治措施等工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 2017年4—6月，分3次采集了海南省海口市3個水果市場上正在出售的38個發病的臺農芒果實。

1.1.2 實驗試劑 北京索萊寶科技有限公司真菌基因組DNA提取試劑盒（100T），南京諾唯贊生物科技有限公司Green Taq Mix。

1.2 方法

1.2.1 臺農芒炭疽菌分離及純化 表面消毒后于無菌操作臺中用無菌解剖刀切取交界處組織（4～ 5 mm），放入無菌水中沖洗30 s，再放入75%的酒精中30 s，取出后無菌水沖洗2次，每次30 s，置于無菌濾紙上吸干表面水分，倒置于PDA培養基上，封口，放入28 ℃黑暗培養箱中進行培養。待長出菌絲后，從菌落邊緣切取三角菌塊，轉移到新的PDA培養基上，繼續28 ℃恒溫培養，得到純菌株。

1.2.2 炭疽菌形態學特征 將菌株接種在PDA培養基上，第7天用滅菌的5 mm打孔器從菌落邊緣選取圓片，并轉移到PDA培養基上，恒溫培養5 d，測量并記錄菌落直徑、顏色和形態，觀察并記錄50個分生孢子的大小和形狀，記錄附著胞形態特征。

1.2.3 炭疽菌分子鑒定

（1）DNA提取、擴增及序列測定 將菌株接種在PDA培養基上培養7 d，刮取適量菌絲放入無菌離心管（1.5 mL）中，采用試劑盒提取DNA。對所有分離篩選獲得的菌株，參照Weir等[5]的研究，選擇核糖體轉錄間隔區（rDNA-ITS）、肌動蛋白（ACT）、谷氨酰胺合成酶（GS）、鈣調蛋白（CAL）、β-微管蛋白（TUB-2）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）共6個基因片段進行擴增、測序。引物序列及退火溫度如表1所示。

（2）多基因系統發育分析 對測定的序列在GenBank中進行Blast比對，下載和選用Damm等[15]、Weir等[5]和Sharma等[16]炭疽菌模式菌株的序列與本研究分離純化獲得的菌株序列共同構建系統發育樹。采用MEGA 6.0構建鄰近法（neighbor-joining，NJ）系統發育樹，所有堿基賦予相同權重，自舉檢驗（boot-straping）重復1 000次以獲得各分支的支持率。

1.2.4 致病性測定及柯赫氏法則驗證

（1）孢子液法。對新鮮芒果表面用75%酒精表面消毒處理，取濃度為15×10倍顯微鏡下每視野30～40個病原菌孢子懸浮液后滴在無傷和有傷（針刺3孔）芒果表面，以無菌水處理作對照（CK），放入培養箱，溫度28 ℃，相對濕度98%。

（2）菌絲塊法。用5 mm打孔器從菌落邊緣取菌絲塊，接種于無傷和有傷（針刺3孔）芒果表面，并在菌絲塊上覆蓋沾有無菌水的脫脂棉保濕，用保鮮膜包裹固定。放入培養箱，溫度28 ℃，相對濕度98%。

對上述致病性測定實驗中發病的臺農芒果實再次分離病原菌，觀察菌落、分生孢子形態及分子序列特征，進一步確認是否與原接種炭疽病原菌一致。

1.2.5 其他芒果品種致病性測定 從市場上購買新鮮、健康的其他品種芒果的果實，表面消毒后，分別采用無傷和有傷2種方式接種炭疽病菌，設置空白對照，重復3次，觀察實驗結果并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 系統發育分析

從樣品中共分離得到38株刺盤孢屬真菌，獲得了每個菌株的rDNA-ITS、CAL、GDPH、ACT、GS和TUB6基因序列。所有228條序列提交GenBank保存（GenBank接收號為ITS：MG783043～ MG783080；CAL：MG783157～MG783194；GDPH：MG783233～MG783270；ACT：MG783081～ MG783118；GS：MG783195～MG783232；TUB：MG783119～MG783156）。其中，ITS、CAL、GDPH、ACT、GS、TUB基因序列Blast比對同源性分別為99%、100%、99%、100%、99%和100%。

從系統發育樹（圖2）中可以看出，38株參與系統學分析的菌株分成了3個進化枝，各進化枝的支持率均較高，分別代表3個分類單元，每個進化支中包含了相應分類單元的模式菌株。其中，M23、M27、M24、M14、M14-1、M25、M5、M6-2、M16、M26、M6、M7和M110共13個菌株與果生炭疽菌（C. fructicola）聚為一支；菌株M15、M9-1、M2-2、M9-2、M2-1共5個菌株與C. siamense聚為一支；菌株M11、M52、M102、M92、M83、M61、M9、M1-1、M12、M17、M17-1、M2、M4-2、M73、M8-1、M4-2、M8、M4-1、M1和M312共20個菌株與C. asianum聚為一支。

2.2 菌株形態學特征

根據形態學特征，38株刺盤孢屬真菌也歸為C. asianum、C. siamense和C. fructicola三種。

2.2.1 亞洲炭疽菌（C. asianum）共分離獲得20株 在PDA培養基上該菌菌落呈灰白色，橙色孢子堆，菌落背面淺黃色，中間深綠色，生長速度10.2 mm/d。分生孢子圓柱狀，兩端鈍圓，部分可見油滴，孢子基部稍寬于頂端，大小（17±1.0） μm×（5.5±0.25） μm。分生孢子可形成黑色附著胞，呈近圓形，褐色，大小為（9.0±1.5） μm×（6.5± 0.5） μm。

2.2.2 暹羅炭疽菌（C. siamense）共分離獲得5株 菌株在PDA培養基上呈地毯狀，菌落近圓形，氣生菌絲由白色和灰白色逐變為深灰色絨狀；菌落背面淺灰色至深灰色，中心顏色深，外部顏色淺；可產生橘黃色的分生孢子堆。5 d平均生長速率為11.4 mm/d。分生孢子為單胞，直、圓柱狀、無色、光滑、兩端鈍圓或一端鈍圓，另一端稍尖，分生孢子大小為（15±1.6） μm×（4.9±0.55） μm；分生孢子附著胞單個或成簇狀分布，淺棕色至深棕色，近球形或短圓柱形，部分輕微不規則形，大小為（9.5±1.9） μm×（5.9±0.85） μm。形態特征與模式菌株一致。

2.2.3 果生炭疽菌（C. fructicola）共分離獲得13株 在PDA培養基上，菌落厚重濃密，棉絮狀，白色至深灰色，圓形，規則完整，邊緣顏色稍淺一些，氣生菌絲絨毛狀，菌落背面黑色素沉淀，灰白色至深灰色，分生孢子堆淺黃色，5 d平均生長速率10.5 mm/d。營養菌絲透明，光滑，有隔膜，分枝；厚垣孢子未發現；未發現剛毛；分生孢子直，無隔膜，圓柱狀或橢圓形，兩端鈍圓或一端略尖，光滑，無色，單胞，大小為（16.5±0.8） μm× （6.0±0.7） μm。在PDA培養基上培養后期可見有性態。分生孢子附著胞單個或成簇狀分布，淺棕色至深棕色，近球形或短圓柱形，大小為（7.5±1） μm× （4.5±0.9） μm。

2.3 柯赫氏法則驗證

通過回接致病性實驗，所有38個菌株的孢子懸浮液和菌絲塊對臺農芒無傷和有傷2種處理的均能發病，發病率為100%，發病癥狀與果實采后自然發病癥狀一致，對照則未發病。對發病果實進行病原菌分離，分離獲得病原菌的培養性狀及分生孢子形態、大小均與接種病原菌一致，因此可確定分離獲得的38個炭疽菌株均為臺農芒炭疽病病原菌。

2.4 芒果品種致病性測定

對不同芒果品種致病性測試結果表明，從采收后臺農芒炭疽病斑上分離的3種病原菌C. siamense、C. asianum和C. fructicola在無傷和有傷的情況下均可侵染紅玉芒、水仙芒、鷹嘴芒、金煌芒、大青芒等芒果果實，形成黑褐色斑點，這些斑點可在較短時間內連成片。其中，紅玉芒極易發病，顯癥時間最短。

3 討論

芒果炭疽病病原種類較多。國外報道芒果炭疽病原主要有C. asianum、C. fructicola、C. dianesei、C. karstii、C. tropicale、C. siamense和C. gloeosporioides[5，8，15-16]。目前我國報道的芒果炭疽病病原菌主要有C. gloesporioides、C. acutatum和C. siamense 3種[9-14]。本研究從采收后的海南臺農芒炭疽病斑上分離到38株炭疽菌，分成3類，分別是C. siamense、C. asianum和C. fructicola。這3種病原菌在國外均有報道，但國內尚未報道C. fructicola。有意思的是，這38個菌株中沒有分離到C. gloeosporioides，這與Phoulivong等[17]的研究發現C. gloeosporioides不是老撾和泰國的芒果炭疽病常見病原的結果一致。另外，本研究未分離到C. acutatum，這與李繼勇[13]報道芒果的一種新的炭疽菌C. acutatum不同。

C. fructicola是國內芒果炭疽病原的首次道導。該菌最初的報道是泰國的咖啡果[18]，其模式種被指定為MFLU090228，該菌株現保存為ICMP 18581。C. fructicola目前已知的寄主有沙梨、補血草、蘋果、草莓、牛油果、榕屬植物、山藥、可可屬植物[5-7]。本研究總共分離獲得13株C. fructicola，形態特征與模式菌株相似，占總分離菌株數的34%。

C. siamense是Prihastuti[18]首次定名的，其模式種為MFLU 09230，該菌株現保存為ICMP 18578。國內報道了長春超市中來自廣西和云南的芒果炭疽病原為C. siamense[14]。除了芒果外，該菌還是油茶和茶樹等植物的病原菌[19]。有研究者認為C. siamense是一個復合種，而Weir[5]對30株C. siamense進行系統發育分析，發現它們形成一個無法再區分的單系分離枝。Liu[20]也認為C. siamense不存在生殖隔離、地理和寄主植物的基因流障礙，不是復合種。本研究共分離獲得5個C. siamense菌株，占總分離菌株的13%。

本研究中，菌株分離率最高的是C. asianum，約占總分離菌株的53%。C. asianum是Prihastuti等[18]從泰國的咖啡樹上首次發現和描述的。目前報道的澳大利亞、哥倫比亞，日本、巴拿馬、菲律賓和南非等地的芒果上均發現了該病原菌[5-8，15-16]。

經病原菌形態學和分子生物學鑒定，本研究明確了臺農芒炭疽病是由C. siamense、C. asianum和C. fructicola三種病原真菌引起，其中C. asianum為優勢種類，而C. fructicola為國內芒果炭疽病原的首次報道。3種炭疽病菌對多種芒果品種均具有致病性。研究結果為采收后芒果炭疽病的正確診斷、流行規律、藥劑篩選和防治等提供理論依據。

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