海洋放線菌Streptomyces sp. HNWSW—49的次生代謝產(chǎn)物研究

吉才娟 王佩 梅文莉 黃小龍 戴好富

摘 要 對1株具有抗芒果炭疽病菌活性的海口灣海泥來源放線菌Streptomyces sp. HNWSW-49發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行研究。采用多種色譜技術(shù)對化合物進(jìn)行分離純化，以波譜數(shù)據(jù)確定化合物的結(jié)構(gòu)。從來源于海口灣海泥的放線菌Streptomyces sp. HNWSW-49發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中分離鑒定了7個(gè)含氮化合物，分別為：環(huán)-（苯丙-丙）二肽（1），環(huán)-（亮-甘）二肽（2），環(huán)-（苯丙-纈）二肽（3），環(huán)-（羥脯-苯丙）二肽（4），N-（2-苯基）乙酰胺（5），β-腺苷（6），和2-哌啶酮（7）。所有化合物均為首次從該放線菌中分離得到，其中化合物6為首次從微生物中分離得到。

關(guān)鍵詞 海泥；放線菌；化學(xué)成分；含氮化合物

中圖分類號 R931.77 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The chemical constituents from the fermentation broth of Streptomyces sp. HNWSW-49， which was isolated from the sediment of Haikou Bay and showed anti-fungal activity against Colletotrichum gloeosporioides in postharvest Mango， was studied. Seven compounds were isolated with various chromatographic techniques. Meanwhile， the structures of the compounds were identified through a combined analysis of physicochemical properties and spectroscopic evidence. They were determined as ascyclo-（Phe- Ala） （1）， cyclo-（Leu-Gly）（2）， cyclo-（Phe- Val） （3）， cyclo-4-OH-Pro-Phe （4）， N-（2-phenylethyl） acetamide（5）， β- Adenosine（6）， and 2-Piperidone（7）. The compounds were obtained from the Streptomyces sp. HNWSW-49 for the first time， while 6 was the first time isolated from microorganisms.

Key words marine sediment； Streptomyces sp. ； chemical constituents； nitrogenous compounds

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.023

海洋占整個(gè)地球表面積的71%，其具有低溫、高壓、高鹽等特殊環(huán)境，且生物多樣性遠(yuǎn)超陸地，是一個(gè)巨大的生物資源來源地。海洋特殊的生存環(huán)境，使得海洋生物形成了有別于陸生生物的新陳代謝途徑、生存繁殖方式和適應(yīng)機(jī)制，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特、具有多種生物活性的次級代謝產(chǎn)物。在對近3年的海洋微生物來源的新化合物統(tǒng)計(jì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)海洋微生物新天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型多樣，其中含氮化合物占總的新天然產(chǎn)物的37%，且含氮化合物的活性率最高[1]。可見，含氮化合物是活性天然產(chǎn)物的重要來源，其藥理活性主要有抗菌作用、抗病毒作用、抗腫瘤作用等[2-10]。在前期化學(xué)篩選中，筆者發(fā)現(xiàn)從海泥中分離的放線菌HNWSW-49發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物含有豐富的含氮化合物。為了探索該系列化合物，本研究對放線菌HNWSW-49進(jìn)行了大批量發(fā)酵，并對其次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 放線菌HNWSW-49分離自海口灣海泥。菌種保藏于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.1.2 儀器與試劑 Polar-L型旋光儀（Catacro Co. Ltd），Bruker AV-600（TMS內(nèi)標(biāo)）核磁共振波譜儀（Bruker），Autospec 300質(zhì)譜儀（Bruker），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph Laborota），高壓濕熱滅菌鍋（Sanyo），CO2培養(yǎng)箱（RSBiotech Ltd.），Sephadex LH- 20（Merck公司），反相材料C-18（FU-JI公司）、柱色譜硅膠和薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠產(chǎn)品），Waters1525高效液相色譜儀（Dionex），Waters C18半制備柱（250 mm×10 mm，5 μm）（Cosmosil）；提取分離用試劑甲醇、乙醇、石油醚乙酸乙酯等試劑（工業(yè)純重蒸），多菌靈（上海生工有限公司）等。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[11]：葡萄糖20.0 g，馬鈴薯200.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L；YE培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖4.0 g，麥芽浸粉10.0 g，NaCl 16.5 g，酵母浸膏4.0 g，瓊脂粉20.0 g；放線菌2號培養(yǎng)基（g/L）：玉米漿3.0 g，葡萄糖20.0 g，淀粉10.0 g，酵母浸膏4.0 g，蛋白胨2.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 30.0 g，K2HPO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，CaCl2 0.5 g，CaCO3 2.0 g。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 接種放線菌HNWSW-49于YE培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌株的形態(tài)特征。同時(shí)提取該菌株的DNA序列為模板，采用7F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）和1540R（5'-AGGAGGT- GATCCAGCCGCA -3'）細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物進(jìn)行純化。之后，送往生物工程（上海）股份有限公司對該菌株16S rDNA基因序列進(jìn)行測定。將測序得到的放線菌16S rDNA基因序列在http：//www.ezbiocloud.net/進(jìn)行在線序列比對，并利用軟件MEGA6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析。

1.2.2 菌株發(fā)酵 在超凈工作臺中，將菌株HNWSW-49放于YE培養(yǎng)基中活化后，切取黃豆大小的菌塊接種于裝有200 mL放線菌2號培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，置于28 曟，180 r/min的三角瓶中振蕩培養(yǎng)11 d，共發(fā)酵200瓶。

1.2.3 菌株化學(xué)成分的提取與分離 菌株純化發(fā)酵結(jié)束后，合并發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入40 L乙酸乙酯，用超聲破碎儀進(jìn)行菌體細(xì)胞的破碎，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮后，采用減壓/加壓正反相硅膠柱色譜、凝膠（Sephadex LH-20）柱色譜及制備型HPLC等分離技術(shù)，對菌株次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離；通過波譜數(shù)據(jù)分析，結(jié)合理化常數(shù)對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1.2.4 抗菌活性測試 平板對峙試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行。采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法[13]對單體化合物的抗菌活性進(jìn)行測試。芒果炭疽病菌采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將樣品溶于氯仿甲醇混合溶液中，配制成終濃度為20 g/L的樣品溶液，取25 μL樣品溶液滴加于事先準(zhǔn)備好的滅菌濾紙片上，待溶劑揮發(fā)紙片完全干燥后，將其貼于涂有100 μL測試菌懸液（菌液濃度105～107 cfu/mL）的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，芒果炭疽病菌（多菌靈為陽性對照）于28 ℃條件下培養(yǎng)，12 h后觀察抑菌情況，并測量抑菌圈直徑進(jìn)行記錄，以氯仿甲醇混合溶液作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HNWSW-49鑒定結(jié)果

放線菌HNWSW-49在YE固體培養(yǎng)基平板上生長良好。在生長初期，該菌株為白色菌落，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，該菌株表面變得干燥并呈現(xiàn)褶皺狀。隨后，產(chǎn)生大量孢子覆蓋于菌落表面，形成綠色菌落（圖1）。

測序結(jié)果顯示，獲得該菌株的16S rDNA基因序列長度為1 440 bp。序列比對表明，該菌株與Streptomyces osmaniensis的相似度為99.08%。選擇序列相似度較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株與該菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該菌株與鏈霉菌Streptomyces osmaniensis聚在同一分支上（圖2），但進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，說明該菌株極有可能為一個(gè)新種。因此，將該菌株初步鑒定為鏈霉菌屬的放線菌。

2.2 芒果炭疽病菌拮抗放線菌的篩選

以芒果炭疽病菌作指示菌，采用對峙培養(yǎng)法，對分離自海口灣海泥的100株放線菌進(jìn)行拮抗活性初篩。由圖3可知，菌株HNWSW-49表現(xiàn)出良好的抑菌效果。提取菌株HNWSW-49的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，作進(jìn)一步的抑菌篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，菌株HNWSW-49發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對芒果炭疽病菌的生長并未表現(xiàn)出拮抗作用。

2.3 化合物的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 化合物的分離 菌株的乙酸乙酯提取物（8.2 g）經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-氯仿和氯仿-甲醇為流動相梯度洗脫，得到11個(gè)流份（Fr. 1～Fr. 11）。Fr. 4（2.1 g）經(jīng)RP-18柱色譜，以甲醇-水梯度洗脫得到38個(gè)流份（Fr. 4-1～Fr. 4-38）。Fr. 4-9、Fr. 4-10結(jié)晶，經(jīng)甲醇洗凈后分別得化合物3（3.0 mg）、5（11.9 mg）。Fr. 4-2（389.8 mg）分別以甲醇-氯仿（體積比為1﹕1）和純甲醇為流動相，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜進(jìn)行分離，再經(jīng)高效液相色譜（C18柱）以25%甲醇-水為流動洗脫得到化合物1（tR 13.0 min，2.2 mg）、2（tR 9.8 min，1.0 mg）、4（tR 12.7 min，1.8 mg）和7（tR 6.8 min，9.9 mg）；Fr. 9（688.1 mg）經(jīng)RP-18柱色譜，以甲醇-水梯度洗脫得到40個(gè)流份（Fr. 9-1～Fr. 9-40）。Fr. 9-1（271.4 mg）分別以甲醇-氯仿（體積比為1﹕1） 和純甲醇為流動相，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜進(jìn)行分離，再經(jīng)高效液相色譜（πNAP柱）以5%乙腈-水為流動相洗脫得到化合物6（tR 6.2 min，1.0 mg）。

2.3.2 化合物的鑒定 化合物1：白色粉末狀，[α]D20 = 22.6（c= 0.07，MeOH），ESI-MS m/z241處給出[M+Na]+峰，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測該化合物分子式為C12H14N2O2。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：8.12（1H，s，NH），8.02（1H，s，NH），7.27（2H，t，J=7.2 HZ，H-10，H-12），7.22（1H，t，J=7.2 Hz，H-11），7.14（2H，d，J=6.9 Hz，H-9，H-13），4.17（1H，m，H-5），3.61（1H，q，J=7.0 Hz，H-2），3.12（1H，dd，J= 3.7，13.4 Hz，H-7），2.85（1H，dd，J=5.0，13.4 Hz，H-7），0.44（3H，d，J=7.0 Hz，H-14）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：49.8（C-2），167.8（C-3），55.5（C-5），166.0（C-6），38.4（C-7），136.1（C-8），130.5（C-9，C-13），128.2（C-10，C-12），126.8（C-11），19.8（C-14）。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[14]比對，化合物1被確定為環(huán)-（苯丙-丙）二肽，即cyclo-（Phe-Ala）。

化合物2：白色粉末狀，[α]D20 = 6.0（c= 0.95，MeOH），ESI-MS在m/z 339處給出[2M-H]-峰，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測該化合物分子式為C8H14N2O2。1H-NMR（CD3OD-d4，500 MHz）δ：4.01（1H，d，J= 17.8 Hz，H-5），3.90（1H，dd，J=5.5，8.1 Hz，H-2），3.83（1H，d，J=17.8 Hz，H-5），1.83（1H，m，H-8），1.68 （2H，m，H-7），0.98（3H，d，J= 6.6，H-9），0.96（3H，d，J = 6.6，H-10）；13C-NMR（CD3OD-d4，125 MHz）δ：54.8（C-2），171.6（C-3），45.2（C-5），168.9（C-6），43.8（C-7），25.3（C-8），23.4（C-9），22.1（C-10）。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[14]比對，化合物2被確定為環(huán)-（亮-甘）二肽，即cyclo-（Leu-Gly）。

化合物3：白色粉末狀，[α]D20 = 10.6（c = 0.15，MeOH），ESI-MS m/z 245處給出[M-H]-峰，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測該化合物分子式為C14H18N2O2。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：8.06（1H，s，NH），7.90（1H，s，NH），7.25-7.15（5H，overlap，H-9，H-10，H-11，H-12，H-13），4.20（1H，dd，J= 3.2，7.8 Hz，H-5），3.52（1H，m，H-2），3.14（1H，dd，J= 4.3，13.5 Hz，H-7），2.86（1H，dd，J= 5.0，13.5 Hz，H-7），1.69（1H，m，H-14），0.64（3H，d，J=7.1 Hz，H-16），0.25（3H，d，J= 6.8 Hz，H-15）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：59.2（C-2），166.4（C-3），55.0（C-5），166.6（C-6），37.8（C-7），136.3（C-8），127.9 （C-9，C-13），130.3（C-10，C-12），126.5（C-11），31.0（C-14），16.2（C-15），18.2（C-16）。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[15]比對，化合物3被確定為環(huán)-（苯丙-纈）二肽，即cyclo-（Phe-Val）。

化合物4：白色粉末狀，[α]D20 = -41.0（c= 0.15，MeOH），ESI-MS m/z 283處給出[M+Na]+峰，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測該化合物分子式為C14H16N2O3。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：7.29-7.20（5H，m，H-9，H-10，H-11，H-12，H-13），4.47（1H，dt，J = 3.3，5.0 Hz，H-5），4.35（1H，ddd，J= 1.7，6.0，11.8 Hz，H-2），4.26（1H，m，H-15），3.69（1H，dd，J=5.1，13.1 Hz，H-16），3.27（1H，dd，J= 8.4，13.1 Hz，H-16），3.15（2H，dd，J = 2.4，5.1 Hz，H-7），2.05（1H，dd，J=5.9，13.0 Hz，H-14），1.35（1H，dd，J=4.2，13.0 Hz，H-14）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：58.3（C-2），171.2（C-3），57.6（C-5），167.1（C-6），38.8（C-7），137.3（C-8），129.5（C-9，C-13），131.0（C-10，C-12），128.1（C-11），38.0（C-14），68.5（C-15），55.2（C-16）。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[16]比對，化合物4被確定為環(huán)-（羥脯-苯丙）二肽，即cyclo-4-OH-Pro-Phe。

化合物5：黃色油狀，ESI-MS在m/z 202處給出[M+Na]+峰，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測該化合物分子式為C10H13NO2。1H-NMR（CD3OD-d4，500 MHz）δ：7.89（1H，s，NH），7.02（2H，d，J= 8.6 Hz，H-5，H-9），6.71（2H，d，J= 8.6 Hz，H-6，H-8），3.33（2H，t，J=7.5Hz，H-2），2.68（2H，t，J= 7.5 Hz，H-3），1.90（3H，s，H-11）；13C-NMR（CD3OD-d4，125 MHz）δ：42.4（C-2），35.6（C-3），131.2（C-4），130.7（C-5，C-9），116.2（C-6，C-8），156.9（C-7），173.2（C-10），22.5（C-11）。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[17]比對，化合物5被命名為N-（2-苯基）乙酰胺。

化合物6：黃色油狀，ESI-MS在m/z 290處給出[M+Na]+峰，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測該化合物分子式為C10H13N5O4。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：8.34（1H，s，H-8），8.13（1H，s，H-2），7.34（2H，s，NH2），5.87（1H，d，J=6.2 Hz，H-10），4.60（1H，t，J=5.5 Hz，H-11），4.14（1H，m，H-12），3.96（1H，m，H-13），3.67（1H，dd，J=12.0，4.2 Hz，H-14），3.55（1H，br d，J=12.0 Hz，H-14）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：152.5（C-2），149.1（C-4），119.4（C-5），156.2（C-6），140.0（C-8），88.0（C-10），73.5（C-11），70.7（C-12），86.0（C-13），61.7（C-14）。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[18]比對，化合物6被鑒定為β-腺苷。

化合物7：黃色油狀，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測該化合物分子式為C5H9NO。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：3.27（2H，t，J=5.8 Hz，H-6），2.30（2H，t，J=6.5 Hz，H-3），1.81（2H，m，H-4），1.75（2H，m，H-5）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：175.0（C-2），32.0（C-3），21.7（C-4），23.0（C-5），42.9（C-6）。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[19]比對，化合物7被確定2-哌啶酮。

化合物1～7的結(jié)構(gòu)式見圖4。

3 結(jié)論

本研究從分離自海口灣海泥的100株放線菌中篩選出1株芒果炭疽病菌的拮抗放線菌StReptomyces sp. HNWSW-49，并從菌株HNWSW-49發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中分離鑒定了7個(gè)含氮化合物。其中4個(gè)環(huán)二肽類化合物，2個(gè)酰胺類化合物和1個(gè)核苷類化合物。活性測試結(jié)果表明，Streptomyces sp. HNWSW-49發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物及從中分離得到的7個(gè)含氮化合物都沒有表現(xiàn)出抗芒果炭疽病菌的活性，原因可能是Streptomyces sp. HNWSW-49抗指示病菌而不是其代謝產(chǎn)物，也可能是其代謝產(chǎn)物有抗目標(biāo)病菌的生物活性，但是活性成分不溶于乙酸乙酯相，所以找不到抗目標(biāo)病菌活性成分。查文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)環(huán)二肽類化合物具有廣泛的生物活性，如抗菌[20]、抗腫瘤[21]、抗真菌[22]等。酰胺類化合物多用于除草、殺蟲及殺菌[23]；核苷類成分是生物細(xì)胞維持生命的重要物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)以及改善腦細(xì)胞代謝等多種生理活性，一些核苷類藥物在醫(yī)療上多用于抗腫瘤和抗病毒治療[24-26]。化合物2具有嗎啡耐受性[27]，4具有很強(qiáng)的體外抗腫瘤活性[28]，6可以促進(jìn)食用菌的產(chǎn)量[18]。本研究表明，海洋放線菌是含氮化合物產(chǎn)生的重要菌源，但這些含氮化合物的應(yīng)用價(jià)值還有待深入研究。