等效面法分析3種氨基甲酸酯類農藥對乙酰膽堿酯酶的聯合作用

葛會林 陶珊珊 智霞 袁宏球 蘇冰霞 馬晨

摘 要 為了更好地評估與預測三元混合物的毒性相互作用，以3種氨基甲酸酯類農藥殘殺威、滅多威、速滅威為研究對象，應用均分等效面設計（EESD）法配制三元混合物，應用直接均分射線設計法（EquRay）配制兩兩混合的二元混合物，測定混合物對乙酰膽堿酯酶（AChE）的抑制效應，基于三角形的3次插值方法構建三元混合物在20%、50%、80%效應的等效面，以濃度加和（CA）與獨立作用（IA）為參考模型分析混合物的毒性相互作用。結果表明，Weibull函數能良好地擬合3種氨基甲酸酯類農藥及其混合物對AChE的濃度-效應數據（R2>0.99，RMSE<0.03）。基于等效面分析，殘殺威、滅多威、速滅威的三元及二元混合物毒性符合CA模型，呈現加和作用，而IA輕微高估了混合物的毒性。共毒系數法也證實這3種氨基甲酸酯類農藥呈現加和作用。回歸分析發(fā)現三元混合物毒性（pECx）與速滅威的濃度分數具有良好的負相關關系。均分等效面設計法與等效面分析法可用于有效評估三元混合物的聯合毒性。

關鍵詞 均分等效面設計法；等效面；氨基甲酸酯類農藥；乙酰膽堿酯酶；濃度加和；獨立作用；加和作用；共毒系數法

中圖分類號 X171.5 文獻標識碼 A

Abstract In order to better assess and predict the combined toxicity of ternary mixture， three carbamate pesticides including propoxur， methomyl and metolcarb were selected as mixture components. The equipartition equivalent-surface design （EESD） method was used to design ternary mixtures， and the direct equipartition ray design （EquRay） was used to design binary mixtures. The toxicities of these mixtures inhibiting acetylcholinesterase were determined using the microplate toxicity analysis method. The equivalent-surfaces at 20%， 50% and 80% effects were constructed based on the triangle-based cubic interpolation method. The concentration addition （CA） and independent action （IA） as the additive reference models were used to analyze the toxic interaction. The results showed that the Weibull function fit well the concentration-response data of the three pesticides and their mixtures with R2>0.99 and RMSE<0.03. Based on the equivalent-surface analysis， the toxicities of ternary and binary mixtures of propoxur， methomyl， and metolcarb conformed to the CA prediction， showing an additive effect， while the IA prediction slightly overestimated the mixture toxicity. The method of co-toxicity coefficient also confirmed this additive effect of propoxur， methomyl， and metolcarb. Meanwhile， it was found that there was a good negative correlation between the ternary mixture toxicity （pECx） and the concentration proportion of metolcarb. The equipartition equivalent-surface design method and equivalent-surface analysis method could be effectively used to analyze the joint toxicity of ternary mixture.

Key words equipartition equivalent-surface design method； equivalent-surface； carbamate pesticides； acetylcholinesterase； concentration addition； independent action； additive effect； co-toxicity coefficient

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.033

氨基甲酸酯類農藥（carbamate pesticides，CBPs）是一種廣譜殺蟲、殺螨、除草劑，具有選擇性強、高效、對人畜和魚類低毒等特點[1]，多以混劑廣泛應用于農林牧業(yè)[2]，但對生態(tài)環(huán)境尤其是水環(huán)境造成的污染與影響日益嚴重[3]。CBPs多與有機磷類和菊酯類藥劑混用，如滅多威和辛硫磷混用防治棉鈴蟲，異丙威和氯氰菊酯混用防治十字花科蔬菜蚜蟲[4]，少數有三元或多元混劑，同類CBPs藥劑之間混用的研究及應用較少。

實際環(huán)境中因農藥混用所殘留的低劑量混合污染物導致的累積毒性與相互作用（加和、協同及拮抗）已引起人們廣泛關注[5]，一般使用酶[6]、細胞[7]、細菌、藻類[8]、魚[9]、鼠等來表征污染物及其混合物的毒性。如孫金秀等[10]研究表明滅多威與辛硫磷、速滅威與甲胺磷以等毒性劑量混配對大鼠急性經口毒性為加和作用，而滅多威與甲基對硫磷為拮抗作用，異丙威與馬拉硫磷為協同作用。張瑾等[11]應用均勻設計射線法研究了五元CBPs混合物對青海弧菌的毒性特點，觀察到組分不同濃度配比可導致加和或拮抗作用。

等效線圖是評價混合物組分間毒性相互作用的常用方法，已用于評價麥田2種除草劑混合物[12]和稻田2種殺蟲劑混合物[13]的聯合作用，確定兩種止痛藥的加和作用藥效[14]，表征抗菌藥物的抑菌動力學[15]等。大多數情況中等效線圖用于分析二元混合物的毒性相互作用。參考等效線的空間幾何意義，對于三元混合物，可構建等效面進行分析，如劉雪等[16]以CA為參考模型，建立了3種除草劑及3種殺蟲劑在50%效應水平下的三維等效面，分析得出三元除草劑混合物呈加和作用，三元殺蟲劑混合物呈現加和作用與拮抗作用。顧中言等[17]用甲維鹽、毒死蜱、吡蚜酮3種藥劑對害蟲的LC50值作理論等效面，研究了田間試驗中混劑對害蟲的毒力和互作效應。然而，基于實驗設計方法應用等效面來系統分析三元CBPs聯合毒性作用規(guī)律的研究鮮有報道。

化學物聯合毒性的評估和預測通常基于CA和IA兩個加和參考模型。CA一般用于預測具有相似毒性作用機制的混合物。CA模型表明，只要毒性單位的總和保持不變，混合物中的每種化合物都可以被另一種化合物替代而不改變總毒性[18]。CA模型在笛卡爾坐標空間可表示為圖形，對于二元混合物是直線形式的等效線，對于三元混合物則是平面三角形形式的等效面。而IA模型通常適用于相異毒性作用機制的化學物質構成的混合物。IA假定毒物首先與不同的分子靶點相互作用，經過生物體內不同的連鎖反應，產生一個共同的毒理學指標；在此假設下，混合物中各組分的效應在概率意義上被認為是彼此相互獨立的[19]。

本研究選擇殘殺威、滅多威、速滅威作為代表性CBPs農藥組分，采用直接均分射線法配制兩兩組合的二元混合物，采用均分等效面設計法配制三元混合物，基于微板毒性分析法測定混合物對乙酰膽堿酯酶（AChE）的抑制效應，建立三者觀測的等效面，通過比較觀測與CA、IA預測的等效面來分析混合物的毒性相互作用，為CBPs在環(huán)境中復合污染的風險評估和農業(yè)上的合理施用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Synergy2型多功能微孔板測定儀（美國BioTek公司），AL204型四位電子天平（梅特勒-托利多公司），雷磁PHS-3E型pH計（上海精密科學儀器有限公司），96孔透明微板（Corning 9018）。

碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）、二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、電鰻AChE、殘殺威（propoxur，PPX）、滅多威（methomyl，MTM）與速滅威（metolcarb，MTC）相關的具體信息見表1。ATCI、DTNB、AChE、PPX、MTM與MTC分別溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（含0.025 mol/L KH2PO4與0.025 mol/L Na2HPO4·12H2O）并避光保存于4 ℃冰箱中。為溶解DTNB，每克DTNB添加0.379 g的NaHCO3[20]。

1.2 方法

1.2.1 混合物實驗設計 基于殘殺威、滅多威與速滅威的儲備液濃度（c0）與EC50，采用均分等效面設計法（待發(fā)表），將構成50%效應等效面的3條等效線各自3等分，從等分點分別作對面2條等效線的平行線，從而將等效面均分為9個全等三角形，將這9個小三角形的重心坐標對應于3個組分的9個濃度配比，設計組分毒性單位比依次為1∶1∶7、4∶1∶4、2∶2∶5、1∶4∶4、7∶1∶1、5∶2∶2、4∶4∶1、2∶5∶2、1∶7∶1的9條混合物射線（G1～G9）。同時依據經典方法設置EC50比混合物射線G0。對于二元混合物，利用直接均分射線法[21]按照毒性單位比1∶5、2∶4、3∶3、4∶2、5∶1兩兩混合設計B1～B15的二元混合物射線，其中B3、B8、B13為EC50比混合物射線。這些混合物射線中各組分的濃度分數見表2。

1.2.2 乙酰膽堿酯酶微板毒性分析 采用基于AChE的微板毒性分析法（待發(fā)表），在96孔微板的前11列設置11個對數梯度濃度污染物，第12列設置空白對照，每孔依次加入50 μL 1 g/L的DTNB、50 μL 1 g/L的ATCI、50 μL 0.2 U/mL的AChE，于412 nm下測定0 min與15 min的OD值，全程使用空調控溫（29±1） ℃。

污染物對AChE的抑制效應E按照公式（1）計算，得到的劑量-效應曲線（DRC）使用公式（2）所示Weibull函數進行最小二乘法擬合并求95%的觀測置信區(qū)間[22]，

計算得到效應濃度如EC80、EC50、EC20等。

式中ΔODt為處理溶液15 min時吸光度變化值，ΔODc為對照溶液15 min時吸光度變化值，C為濃度，E為效應，a為位置參數，b為斜率參數。

1.2.3 混合物毒性預測與評估 使用公式（3）所示CA模型與公式（4）所示IA模型構建混合物的等效面，對混合物毒性進行預測與評估。為了驗證等效面分析法，同時采用簡單、實用的共毒系數法[23]評估混合物的毒性相互作用。將3個組分中毒性最大的滅多威（MTM）作為標準藥劑，各組分的毒力指數（toxicity index，TI）按公式（5）計算，混合物的理論毒力指數（theoretical toxicity index，TTI）按公式（6）計算，混合物的實際毒力指數（actual toxicity index，ATI）按公式（7）計算，根據公式（8）求得混合物的共毒系數（co-toxicity coefficient，CTC）。混合物CTC值小于80%為拮抗作用，大于120%為協同作用，80%～120%之間為加和作用。

式中n是混合物的組分數，ci是產生效應x%的混合物中組分i的濃度，ECx，i是組分i單獨引起x%效應時的濃度，ECx，mix是產生x%效應的混合物濃度，Pi是組分i在混合物中的濃度分數，Emix為混合物的效應，Ei為組分i產生的效應。

2 結果與分析

2.1 單個化合物劑量-效應曲線分析

從圖1可看出，殘殺威、滅多威、速滅威對AChE抑制毒性的DRC呈良好的S型曲線，空白變異在測試中控制在了±10%以內。DRC經最小二乘法回歸的統計參數見表2，均方根誤差（RMSE）均小于0.03，決定系數（R2）均大于0.99，擬合統計性顯著。故單個物質DRC可用Weibull函數有效表征，擬合得到的參數如DRC位置參數a、斜率參數b、EC80（80%效應濃度）、EC50（50%效應濃度）、EC20（20%效應濃度）等列于表2。

殘殺威、滅多威、速滅威的a值分別為9.360、9.466、6.495，殘殺威與滅多威的a值相差不大，兩者的毒性差異也不大，但與速滅威的毒性差異較大。基于EC50，可得出對AChE抑制效應的大小順序為：滅多威>殘殺威>速滅威，滅多威與速滅威EC50的差距接近兩個數量級，單個物質各自的EC80與EC20的差距接近一個數量級。3個物質的b值分別為1.834、1.753、1.760，表明三者DRC曲線的陡度接近，毒性隨濃度的增加變化趨勢也相近（圖1）。

2.2 基于劑量-效應曲線的混合物毒性分析

圖2為三元混合物射線G0～G9與二元混合物射線B1～B15對AChE的DRC。結果表明，所有混合物射線的DRC都可用Weibull函數有效擬合，R2均大于0.99，RMSE均小于0.03。擬合得到混合物射線的效應濃度EC80、EC50、EC20同列于表2。觀察后發(fā)現，二元或三元混合物射線的EC80、EC50、EC20都分別位于組分EC80、EC50、EC20的最大值與最小值之間。

綜合來看，對于三元及二元混合物射線，CA模型預測的DRC均位于觀測DRC的95%置信區(qū)間內，混合物呈現加和作用，其中G0、G1、G4、G6、G7、G9、B2、B3、B5～B7、B9～B15混合物射線的觀測DRC良好符合CA預測的DRC。而IA模型輕微地高估了混合物毒性，同時IA預測的DRC均在CA預測DRC的上方。

2.3 基于等效面的混合物毒性相互作用分析

圖3為三元混合物在20%、50%、80%效應的等效面的正視圖及側視圖，包括混合物觀測等效面、CA預測等效面和IA預測等效面三部分組成。圖3中的黑點為觀測等效點，共28個，分別是三角形邊線上的15個二元混合物觀測等效點，三角形內10個三元混合物的觀測等效點，三角形3個頂點的單個組分的觀測等效點，所有的黑點都是等效應的。黑點兩側的黑線為其95%置信區(qū)間，二元混合物觀測等效點的置信區(qū)間在正視圖中給出，三元混合物觀測等效點的置信區(qū)間在側視圖中給出。

這28個等效點通過基于三角形的三次方程插值得到混合物的觀測等效面，即圖中的網格曲面。而CA預測的等效面為圖3中的紅色三角形平面，IA預測的等效面為向內凹的藍色三角形曲面。三角形等效面的3條邊為相應二元混合物的觀測或預測的等效線。基于模型（CA與IA）預測的三元混合物等效面與二元混合物等效線的數學方程見表3。

圖3的20%、50%、80%效應的等效面正視圖中，二元混合物的15個觀測等效點基本都符合CA模型；IA預測等效線相對CA內凹，但總體上也位于觀測點的置信區(qū)間內。在側視圖中，網格顯示的觀測等效面均位于CA與IA構成的加和性空間中，其中80%效應的觀測等效面很好地符合CA模型。基于圖3的等效面分析可知，殘殺威、滅多威、速滅威的三元及二元混合物在20%、50%、80%效應水平均為加和作用。上述結果與基于DRC的分析一致。

2.4 共毒系數法驗證

從表4可知，除G3在20%效應水平的CTC為120.48%外，G0～G9混合物射線在20%、50%、80%效應水平的CTC值的范圍為93.01%～113.82%，呈現良好的加和作用。這與基于劑量-效應曲線及基于等效面的混合物毒性相互作用分析結果相同。共毒系數法與CA等效面法判斷結果一致，進一步證明等效面法可用于三元混合物毒性相互作用分析與判斷的可行性。

2.5 混合物毒性與單個物質濃度分數的關系

將單個組分濃度分數與三元混合物毒性（pEC20、pEC50、pEC80）做散點圖，觀察到混合物毒性與殘殺威、滅多威的濃度分數沒有明顯的相關關系，但兩者散點圖的分布模式較為相似；混合物毒性與最小毒性組分速滅威的濃度分數具有較好的負相關（R2均大于0.91），擬合曲線見圖4。這表明混合物毒性可能與其中組分的濃度分數具有相關關系。

3 討論

農藥混配后所產生的聯合作用與藥劑種類[10]和混配比例[24]密切相關。同種藥劑由于作用靶位點相同，理論上呈現加和作用。其中有機磷農藥作為較早進行聯合暴露風險評估的化合物[25]，研究尤為深入。二元有機磷混合物大多數呈現加和作用[26]，也有部分呈現協同作用如毒死蜱和馬拉硫磷[27]，部分呈現拮抗作用如辛硫磷與甲基對硫磷[10]。少數報道評估了氨基甲酸酯類農藥的聯合作用。如涕滅威、殘殺威、呋喃丹、滅多威、抗蚜威對青海弧菌的聯合毒性研究中，觀察到拮抗作用多于加和作用，混合物毒性與組分毒性處于中間的滅多威的濃度分數呈良好的負相關性[11]。而本研究中混合物毒性與最小毒性組分速滅威的濃度分數具有較好的負相關。另一方面，Ge等[28]在研究苯胺類、硝基苯類、苯酚類和鄰苯二甲酸酯混合物對發(fā)光菌Q67的聯合作用時，觀察到混合物毒性與最大毒性組分鄰苯二甲酸二乙酯的濃度分數具有良好的正相關關系。

殘殺威、滅多威、速滅威對AChE的聯合作用符合CA加和作用。一般認為混合物組分具有相似毒性作用機制時可采用CA預測，若相異則可采用IA預測[19]。事實上，CA與IA僅是2個數學方程，與化合物毒性作用機制聯系起來還需要從機理方面進行嚴格的論證；但在實際情況中，CA用于相似作用物的機會更多一些。劉樹深等[29]認為CA仍只是一個工作模型，沒有堅實的理論支持，也不宜與作用機理相關聯。

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