苦瓜枯萎病抗性材料Thai4—6的遺傳模型分析

劉子記　朱婕　牛玉　楊衍

摘 要 苦瓜枯萎病是尖孢鐮刀菌苦瓜專化型引起的真菌病害，探明苦瓜枯萎病的抗性遺傳機制對制定抗病育種策略具有現實指導意義。本文以抗枯萎病苦瓜材料Thai4-6和感病材料CN19-1為親本配制雜交組合，基于該組合6世代遺傳群體（P1、P2、F1、F2、BCP1和BCP2），采用主基因+多基因混合遺傳模型分析枯萎病抗性遺傳特性。數據分析結果表明，該雜交組合的枯萎病抗性呈連續分布，最適模型為2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因遺傳模型（E-1），2對主基因加性效應值均為–13.85，顯性效應值分別是25.58和34.26，主基因遺傳率在BCP1、BCP2和F2中分別是86.03%、80.34%和94.25%，表明該組合枯萎病抗性主要受2對主基因控制。環境因素引起的變異在3個分離世代群體中分別占13.97%、14.06%和5.75%。本研究可為抗枯萎病苦瓜育種提供理論依據。

關鍵詞 苦瓜；混合遺傳模型；枯萎病抗性；遺傳分析

中圖分類號 S642.5 文獻標識碼 A

Abstract Bitter gourd wilt is a fungus disease caused by Fusarium oxyspoorum Schl. f. sp. momodicae Sun & Huang. Exploring resistance mechanism has practical guiding significance for wilt resistance breeding of bitter gourd. Crosses had been made between bitter gourd line Thai4-6， high resistant to fusarium wilt and CN19-1， high susceptible to fusarium wilt. The inheritance of fusarium wilt resistance was analyzed with P1， P2， F1， BCP1， BCP2 and F2 populations through employing the major gene plus polygene mixed inheritance model. The results showed that the wilt resistance in the populations of F2， BCP1， and BCP2 was a continuous distribution. The most suitable model was E-1 model， two major genes with additive-dominance-epistasis effects plus polygenes with additive-dominance effects. The additive effect of the 2 major genes was –13.85 and the dominance effect was 25.58 and 34.26， respectively. The heritability value of the major genes in BCP1， BCP2， and F2 was 86.03%， 80.34% and 94.25%， respectively. The results showed that the wilt resistance was mainly controlled by 2 major genes. The environmental variation in BCP1， BCP2， and F2 accounted for 13.97%， 14.06% and 5.75%， respectively. This study could provide a theoretical basis for the wilt resistance breeding of bitter gourd.

Keywords bitter gourd； wilt resistance； mixed genetic model； genetic analysis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.005

苦瓜（Momordica charantia L.， 2n=2x=22）起源于非洲地區，在美洲及亞洲，尤其南亞和東南亞地區有著悠久的種植歷史[1-2]。苦瓜營養價值很高，富含多種營養物質。此外，苦瓜所含的藥理活性成分具有抗腫瘤細胞增殖[3]、降低血糖水 平[4]、消炎[5]和提高人體免疫力[6]等功效。苦瓜是海南省冬季“南菜北運”的一種主要瓜菜，為豐富全國人民的“菜籃子”提供了有力保障。

苦瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌苦瓜專化型（Fusarium oxyspoorum Schl. f. sp. momodicae Sun & Huang）引起，是對苦瓜生產危害最為嚴重的一種土傳真菌性病害[7]，嚴重影響苦瓜的產量和品質[8]。近年來，隨著重茬種植面積不斷擴大，苦瓜枯萎病的危害日益嚴重，已成為苦瓜安全生產的限制性因素。如何有效地防治苦瓜枯萎病是生產上迫切需要解決的關鍵問題。與其他防治措施相比，選育和推廣抗病品種是防治苦瓜枯萎病最為經濟和有效的措施，對于促進苦瓜生產的可持續發展具有重要意義。有關苦瓜抗枯萎病種質篩選的研究已有一些報道，朱天圣等[9]、郭堂勛等[10]、羅方芳等[11]、曾華蘭等[12]分別對苦瓜主栽品種及種質資源進行枯萎病抗性鑒定，鑒定結果并未發現高抗枯萎病的苦瓜材料。陳振東等[13]鑒定了143份苦瓜種質資源對枯萎病的抗性，僅發現1份高抗級別的材料，未發現對枯萎病表現免疫的材料。了解枯萎病抗性的遺傳規律，可為抗病品種選育提供參考，加速育種進程。

抗病性大部分屬于數量性狀，遺傳規律比較復雜，常因研究材料不同具有不同的遺傳模式，可由主基因組成、微效多基因組成、也可以由主基因與微效多基因共同組成。瓜類作物枯萎病抗性遺傳呈現多樣化的特點。在西瓜中有顯性單基因和多基因控制枯萎病抗性的報道[14-15]，黃瓜對枯萎病的抗性有顯性單基因、部分隱性基因和多基因控制的報道[16-17]。近年來主基因+多基因混合遺傳模型多世代聯合分析方法已廣泛應用于不 同植物數量性狀的遺傳分析[18]，如小麥線蟲抗 性[19]，水稻稻曲病和條葉枯病抗性[20-21]、甘藍型油菜角果長度[22]、櫻桃番茄的果形[23]、花生產 量[24]、棉花的耐低溫[25]、黃瓜種子休眠[26]等性狀。趙秀娟等[27]以苦瓜抗病親本‘0417和感病親本‘472113為材料，采用卡方檢驗分析了苦瓜對枯萎病抗性的遺傳規律，結果表明顯性單基因控制苦瓜對枯萎病的抗性。苦瓜對枯萎病抗性的遺傳研究至今報道較少，因此開展苦瓜枯萎病抗性遺傳規律研究，可以為苦瓜抗枯萎病育種提供參考。本研究擬采用苦瓜高抗枯萎病材料‘Thai4-6和高感枯萎病材料‘CN19-1配制雜交組合，利用親本P1、親本P2、F1、BCP1、BCP2和F2分離群體，基于主基因+多基因混合遺傳模型多世代聯合分析方法，解析苦瓜枯萎病抗性遺傳規律。

1 材料與方法

1.1 材料

親本材料為Thai4-6（P1）和CN19-1（P2）。Thai4-6是由泰國引進對苦瓜枯萎病菌表現高度抗病，生長勢較強，晚熟。CN19-1是由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所選育的高代自交系，對苦瓜枯萎病菌表現高度感病，早熟。

2016年春，在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所蔬菜實驗基地種植親本材料Thai4-6（P1）和CN19-1（P2），配制雜交組合獲得F1（Thai4-6CN19-1）種子。2016年秋F1自交獲得F2分離群體，并配制BCP1（F1Thai4-6）和BCP2（F1CN19-1）群體。共獲得了6個世代（P1、P2、F1、F2、BCP1和BCP2）種子。2017年春對F2、BCP1和BCP2單株進行自交獲得每個單株家系的種子。

1.2 方法

1.2.1 苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液的制備 苦瓜枯萎病株收集自海南省屯昌縣苦瓜主栽區，采用組織分離法進行病原菌分離，通過培養物形態特征及分子水平鑒定、致病性及寄主專化型測定，結果表明，分離物屬于尖孢鐮刀菌苦瓜專化型[28]。取苦瓜枯萎病菌絲接種于PDA液體培養基中，于25 ℃黑暗條件下震蕩培養7 d。采用紗布過濾去掉菌絲，濾液以4 000 r/min離心3 min，倒掉上清液，利用無菌水洗出沉淀的孢子。孢子的濃度采用血球計數器進行計算，接種用孢子濃度為1106 CFU/mL。

1.2.2 抗病性鑒定 2017年5月，在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所蔬菜實驗基地溫室內進行抗病性鑒定，先用55 ℃溫水浸泡苦瓜種子10 min，經過浸種8 h、于30 ℃溫箱中催芽24 h后播于預先滅菌的培養土中。P1種植120株，P2種植125株，F1種植150株，每5株為1重復。F2、BCP1、BCP2每個單株家系種植20株。待幼苗長至2～3 片真葉時，自營養缽內小心挖出植株，經清水洗凈后，采用浸根法進行接種[13]，將苦瓜幼苗根部置于孢子懸浮液中浸泡30 min，然后移栽到營養缽中，按照常規措施進行管理。接種15 d后開始調查發病情況，參照周凱南等[29]的方法，將植株病情分為5級，0級：無明顯癥

狀；Ⅰ級：子葉明顯變黃；Ⅱ級：子葉變黃并逐漸萎蔫，維管束輕度變色；Ⅲ級：子葉枯死，維管束變成淺褐色，真葉開始發黃；Ⅳ級：維管束變成褐色，整株萎蔫并最終枯死。病情指數=100× Σ（各級病株數×各級代表值）/（調查總株數×最高級代表值）。其中病情指數0～15為高度抗病類型（HR），15～30為抗病類型（R），30～50為中度抗病類型（MR），50～70為感病類型（S），70～100為高度感病類型（HS）。

1.3 數據分析

采用主基因+多基因混合遺傳模型多世代聯合分析方法[18， 30]，對苦瓜枯萎病抗性遺傳特性進行分析，根據AIC值最小準則選擇遺傳模型及備選模型，通過U12、U22、U32、nW 2和Dn進行適合性檢驗，根據結果選擇最佳遺傳模型。各基因的效應值、方差和遺傳率等遺傳參數采用最小二乘法進行估計。采用SAS 9.0軟件計算平均數和多重比較。

2 結果與分析

2.1 表型數據分析

比較親本和F1群體病情指數數據表明，Thai4-6（P1）和CN19-1（P2）的病情指數分別為22.29和86.22，親本間差異達到顯著水平（p< 0.05），雜交種F1的病情指數為33.56，介于雙親

之間，與雙親的差異達顯著水平（p<0.05）（表1）。將3個世代群體（BCP1、BCP2和F2）病情指數分組，統計其分布頻次，結果表明，該組合枯萎病抗性病情指數呈連續性分布，具有廣泛的遺傳變異和數量性狀遺傳特征。另外，B1、B2、F2病情指數次數均呈多峰分布，其中BCP1有2個峰，BCP2有3個峰，F2有3個峰（表2），表明苦瓜枯萎病抗性遺傳符合主基因+多基因的遺傳特征。

2.2 枯萎病抗性的遺傳模型分析

采用主基因+多基因混合遺傳模型對Thai4- 6×CN19-1組合6世代（P1、P2、F1、BCP1、BCP2和F2）枯萎病抗性進行聯合分析，A類（1對主基因）、B類（2對主基因）、C類（多基因）、D類（1對主基因+多基因）、E類（2對主基因+多基因）共5類24種遺傳模型的AIC值通過ECM算法計算獲得（表3），根據AIC值最小選擇準則，E-1模型的AIC值最小，D-0和B-1模型的AIC值與E-1模型比較接近，可作為遺傳分析的備選模型。

對E-1、D-0和B-1模型進行一組適合性檢驗（U12、U22、U32、nW2和Dn），檢驗結果顯示，E-1模型達到顯著水平（p<0.05）的檢驗統計量為0個，B-1模型達到顯著水平（p<0.05）的檢驗統計量為0個，D-0模型達到顯著水平（p<0.05）檢驗統計量為1個，根據達到顯著水平統計量最少的原則和AIC值最小準則，適于苦瓜枯萎病抗性遺傳分析的模型為E-1（MX2-ADI-AD，2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因混合遺傳模型）（表4）。

2.3 一階、二階遺傳參數估算

根據最優遺傳模型估算苦瓜枯萎病抗性遺傳的一階、二階遺傳參數。影響枯萎病抗性的2對主基因加性效應值相等，為–13.85；2對主基因的顯性效應值（ha和hb）分別為25.58和34.26。2對主基因的加性效應互作（i）為16.30，顯性效應間互作（I）為–57.71，加性和顯性效應之間的互作（jab和jba）分別為–6.41和19.34，該結果表明2對主基因之間的互作可能對枯萎病抗性影響較大。2對主基因的顯性度分別為–1.85和–2.47，說明2對主基因為超顯性（表5）。BCP1、BCP2和F2分離世代群體遺傳率分別為86.03%、85.94%和94.25%。BCP1、BCP2和F2 3個分離世代群體主基因遺傳率分別為86.03%、80.34%和94.25%，分別占總遺傳率的100%、93%和100%，多基因遺傳率分別為0、5.60%和0，該結果表明2對主基因主要控制苦瓜枯萎病抗性。環境因素引起的變異在3個分離世代群體中分別占13.97%、14.06%和5.75%（表6）。

3 討論

明確枯萎病抗性的遺傳規律，選育和推廣抗性品種是防治苦瓜枯萎病最為有效的措施。以往研究多通過人為確定抗病和感病標準，然后對試驗群體進行卡方測驗研究抗性遺傳規律。人為劃分抗、感標準帶有主觀性，很難準確判斷處于抗感分界附近的材料是抗病還是感病[20]。本研究以抗枯萎病苦瓜材料Thai4-6和感病材料CN19-1為親本配制雜交組合，構建了6世代遺傳群體（P1、P2、F1、BCP1、BCP2和F2），從3個世代分離群體（BCP1、BCP2和F2）的頻次分布來看，枯萎病抗性表現為連續分布，呈現數量性狀的遺傳特征，因此本研究采用適于數量性狀遺傳分析的主基因+多基因混合遺傳模型，鑒于不同分離世代的整體信息確定最佳遺傳模型，從而避免了人為抗感分級引起的誤差。另外，該方法除了估計主基因遺傳效應外，還可以檢測出基因間的互作效應及多基因效應，進一步豐富了遺傳信息。

本研究采用主基因+多基因混合遺傳模型分析了苦瓜對枯萎病抗性的遺傳特性，符合2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因混合遺傳模型。本研究結果與趙秀娟等[27]的研究結果不太一致，除了與所選用的抗原材料遺傳背景、病原菌優勢生理小種不同有關，還有可能因所用的遺傳分析方法不同所致。

本研究結果表明，Thai4-6×CN19-1組合對枯萎病抗性的遺傳由2對主基因和多基因控制，2對主基因間存在加性、顯性、加加互作、加顯互作、顯加互作、顯顯互作作用，多基因間存在加性和顯性作用，因此，適宜的雜交組合可以獲得強雜種優勢。苦瓜對枯萎病的抗性主要受主基因控制，主基因遺傳率在BCP1、BCP2和F2中分別是86.03%、80.34%和94.25%，為了防止抗性基因在世代傳遞過程中效應減退或丟失，可以在育種的早期世代進行選擇，獲得穩定的抗病骨干材料。在BCP2回交世代中多基因遺傳率占有一定比例，為5.60%，BCP1和F2代無多基因遺傳率。環境條件變異也對枯萎病抗性產生了部分影響，3個分離世代群體環境因素引起的變異分別占13.97%、14.06%和5.75%。該結果表明回交群體受環境因素的影響較大。

本研究初步揭示了苦瓜對枯萎病抗性的遺傳特性，為苦瓜抗病育種提供了新的理論依據。在未來的研究中將會對Thai4-6×CN19-1 F2群體中控制枯萎病抗性的基因進行數量性狀位點定位，鑒定與主效抗性基因緊密連鎖的標記，通過分子標記輔助選擇技術培育抗病品種。另外一方面對抗病基因進行精細定位與克隆，進一步從分子水平上闡明苦瓜對枯萎病抗性遺傳的分子基礎。

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