文心蘭生物鐘相關基因PRR7克隆與表達分析

楊翠萍　胡進　閆冰玉　鞏笑笑　譚玉榮　高璇　王丹　張恒　劉進平

摘 要 利用轉錄組文庫中的PRR7基因序列，從文心蘭盛開期花瓣中擴增得到文心蘭PRR7基因的2個成員，分別命名為OnPRR7-1（GenBank登錄號：MG543993）和OnPRR7-2（GenBank登錄號：MG543994）。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因全長分別為2 091 bp和2 154 bp，分別編碼696和717個氨基酸大小的蛋白質序列。蛋白質二級結構分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2均為疏水性蛋白。BlastX比對和系統發育分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因和鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭的PRR基因同源性比較高。實時熒光定量PCR分析結果表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因均呈現晝夜節律性表達格式，并且在正午12點時表達量達到峰值；在花發育和衰老過程中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在花瓣中的表達量均在綻口期和衰老初期達到峰值，表明其有可能在花發育的開花和花衰老的過程中發揮作用。

關鍵詞 文心蘭；生物鐘；PRR7基因；表達分析；開花；花衰老

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract Two members of Oncidium PRR7 gene family， OnPRR7-1 and OnPRR7-2， were isolated from the petals of the full-opened flowers based on the predicted PRR7 gene sequence through transcriptome analysis. The full-length of OnPRR7-1 and OnPRR7-2 was 2 091 bp and 2 154 bp in length， encoding peptides with 696 and 717 amino acids， respectively. Secondary structure modeling showed that these proteins were hydrophobic. BLASTX alignment and phylogenetic analysis showed that the OnPRR7-1 and OnPRR7-2 had high homology with the the counterparts of Dendrobium officinale and Phalaenopsis equestris. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that OnPRR7-1 and OnPRR7-2 genes both had a circadian expression pattern， with the expression levels peaked at 12：00 within 24 hours. During the flower development and senescence， the expression levels of OnPRR7-1 and OnPRR7-2 in petals reached the peak at the bud burst stage and the initial stage of senescence， suggesting that they play a role in flowering and flower senescence in Oncidium.

Keywords Oncidium； circadian clock； PRR7 gene； expression analysis； flowering； flower senescence

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.015

生物鐘（circadian clock）是生物體內一種內在計時機制，是生物體對地球光照和溫度等環境因子晝夜周期變化長期適應而演化產生的適應機制[1-4]。在植物體中，可以使體內生物學過程與體

外的晝夜和季節條件變化同步化，從而調控新陳代謝活動并在最有利的晝夜和季節時間來分配資源[5]。生物鐘對于植物的生長、發育、生殖和脅迫反應都有調控作用[1-5]。在生物鐘系統核心為一套復雜的、環環相扣的轉錄和翻譯反饋環路組成。生物鐘核心振蕩器由3個循環組成：中心循環、早晨循環、傍晚循環[2]。其中PRRs（pseudo- response regulators）為植物轉錄/翻譯晝夜節律網絡中的關鍵成分，在生物鐘系統中的中央振蕩器和生物鐘輸出過程起著至關重要的調控作用[6]。

目前擬南芥中發現參與生物鐘調控的PRRs共有5個，分別是PRR1/TOC1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9[1-2]。擬南芥中PRR家族成員在一天里表達峰值按照PRR9、PRR7、PRR5、PRR3、PRR1的順序依次出現，間隔2～3 h。其中PRR9出現在黎明，而PRR1表達峰值出現在傍晚[7]。這5個成員因為與原核生物的磷酸化和脫磷酸化雙元信號系統的受體RR（response regulator）有很高的同源性而被命名為PRRs家族。PRRs基因均具有兩個保守的結構域，分別是氨基端的RLD（receiver-like domain）結構域和羧基端CCT（CONSTANS/CONSTANS-LIKE/TOC1）結構域[8-10]。目前，除在模式植物擬南芥和水稻中PRR基因研究較為充分外，在少數重要作物如玉米、高粱、大麥、小麥和甜菜等也有少數的研究，但尚未見到在觀賞園藝植物上相關基因研究的報道[11]。

對于PRR7基因的研究不多，但是先前有研究表明 PRR7-β-葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白定位于細胞核，意味著其可能在調控光敏基因表達中起作用，并經研究發現PRR7可作為光敏色素調節的基因表達中信號傳導的中間體，負責響應于光的幼苗的消長和生物鐘的階段[12]。擬南芥的生物鐘是由一系列的互鎖反饋循環環組成，PRR7和PRR9在早上循環環中起作用；經prr7/prr9雙突變體研究發現，PRR7和PRR9在調節CCA1和LHY響應環境溫度的活動中發揮作用[13]。

文心蘭（Oncidium）屬于蘭科文心蘭屬植物，又名舞女蘭、金蝶蘭等，是世界上重要的切花品種，具有極其重要的觀賞價值和經濟價值[14-15]。栽培的文心蘭切花品種以黃色花南茜種（Oncidium Gower Ramsey）及其變異種為主[14-15]。海南大學熱帶農林學院劉進平課題組研究表明，文心蘭花發育可根據其形態特征明確分期，是一種很好的花發育和衰老的研究系統[16-18]。此前劉進平課題組已從文心蘭中克隆和鑒定出一系列跟花發育和衰老相關的基因[19-23]。植物能精確地控制其開花時間，以確保其能成功地進行繁殖。開花時間的季節控制的一個重要因素是光周期，而日照時長由體內生物鐘所測量的。因此，生物鐘對光周期反應和植物開花具有重要的調控作用[24-25]。我們最近的轉錄組學研究表明，生物鐘基因PRR7基因可能還參與了花瓣衰老的啟動調控。

本研究利用轉錄組分析所獲得的序列，克隆到生物鐘相關基因PRR7，并利用生物信息學方法分析了該基因推定的蛋白質的結構，利用序列比對構建了系統進化樹，并研究了PRR7基因晝夜節律性表達及在文心蘭切花發育和衰老過程中在花瓣中的基因表達格式。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為文心蘭南茜種‘黃金3 代（Oncidium Gower Ramsey ‘Gold 3）鮮切花。購自海南出入境檢驗檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心。

1.2 方法

1.2.1 文心蘭花瓣總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 取2～3個文心蘭花瓣于預冷的研缽中，在液氮環境下充分研磨成粉末狀，之后用通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型，購自北京百泰克生物技術有限公司）提取RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，并且測量RNA的濃度。獲得高質量RNA后，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（購自TaKaRa公司）說明進行反轉錄反應，合成cDNA第一鏈。

1.2.2 文心蘭PRR7基因的克隆 利用轉錄組測序得到的差異表達基因PRR7序列片段，用NCBI的Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.

gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行保守結構域分析，然后用NCBI的ORFfinder（https：//www.ncbi. nlm. nih.gov/orffinder/）分析序列的開放閱讀框，并根據ORF兩端設計上下游引物PRR7-F和PRR7-R（表1），克隆PRR7基因的ORF序列。PCR反應體系如下：TaKaRa LA Taq 0.5 ?L，10× LA Taq Buffer 5 ?L，dNTPs 8 ?L，cDNA 1 ?L，上下游引物各0.5 ?L，滅菌蒸餾水 34.5 ?L。PCR程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 15 s，30個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用OMEGA Gel Extraction Kit（購自TaKaRa公司）進行膠回收，回收目的片段，之后連接到pMD-19T載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，過夜培養，進行菌落PCR鑒定，獲得陽性克隆后送上海英濰捷基生物公司進行測序。

1.2.3 PRR7-1和PRR7-2基因生物信息學分析 利用NCBI的ORFfinder進行ORF和編碼氨基酸序列預測；用ExPASy在線分析軟件（https：//www.expasy.org/vg/index/Protein）進行蛋白質理化性質的預測，包括蛋白質等電點和相對分子質量和蛋白質二級結構預測（SOPMA & CoILS），用Swiss-model（https：//swissmodel. expasy.org）預測蛋白質的三級結構，使用TMHMM Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）進行跨膜預測，使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列的多重比對，并且使用MEGA 6.0軟件構建NJ系統進化樹。

1.2.4 文心蘭PRR7基因的節律性表達分析以及在花發育過程中的表達分析 文心蘭PRR7基因的節律性表達分析取樣方法為：首先將購買的100枝文心蘭鮮切花在12 h光照和12 h黑暗（12L：12D），預處理2～3 d，然后每隔2 h采樣，總共采樣時間48 h；文心蘭PRR7基因在花發育過程中的表達分析取樣方法為早上8點采集分別處于花苞期、綻口期、半開放期、盛開前期、盛開期、衰老初期、衰老期和脫落干枯期8個階段的文心蘭花瓣。采用1.2.1節中的方法進行花瓣總RNA的提取和反轉錄反應。用Actin檢測基因對反轉錄得到的cDNA進行質量的檢測，Actin基因作為內參。所用引物序列見表1。Q-PCR表達分析的反應體系如下：SYBR Primix TaqTM 10 ?L，cDNA模板 2 ?L，ddH2O 6.6 ?L，DyeII 0.4 ?L，上下游引物各0.5 ?L。每個不同來源的模板都進行3次生物學重復實驗。PCR程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個循環。最后采用2–ΔΔCt法進行目的基因的表達量分析。

1.2.5 文心蘭PRR7-1和PRR7-2基因差異驗證 考慮到兩個基因僅存在60 bp左右堿基的明顯差異，所以Q-PCR對這兩個基因進行區分驗證時采用相同的下游引物PRR7-R-Q，而上游引物PRR7-1-F-Q是在差異序列之前區域設計的引物，上游引物PRR7-2-F-Q則是在差異序列區域設計的引物；以PRR7-1和PRR7-2為模板，以Q-PCR設計的引物PRR7-1-F-Q和PRR7-R-Q，及PRR7-2-F-Q和PRR7-R-Q為引物分別進行PCR擴增反應，觀察擴增產物的異同。

2 結果與分析

2.1 文心蘭PRR7基因cDNA的克隆

以文心蘭花盛開前期的花瓣RNA反轉錄產生的cDNA為模板，PCR擴增得到兩條2 000 bp左右的條帶（圖1），分別命名為OnPRR7-1（GenBank登錄號：MG543993）和OnPRR7-2（GenBank登錄號：MG543994）。

2.2 文心蘭OnPRR7-1和OnPRR7-2差異序列驗證

OnPRR7-2序列中間部分有60 bp左右的序列與OnPRR7-1序列差異比較大，因此使用設計的Q-PCR引物OnPRR7-1-F-Q與OnPRR7-R-Q，及OnPRR7-2-F-Q與OnPRR7-R-Q對2個基因進行驗證.其中OnPRR7-2-F-Q引物是根據差異序列設計的引物，擴增結果如圖2所示。圖2中泳道1為以OnPRR7-1為模板，以OnPRR7-2-F-Q和OnPRR7-R-Q為引物的擴增結果；泳道2為以

OnPRR7-1為模板，以OnPRR7-1-F-Q和OnPRR7- R-Q為引物的擴增產物，產物大小76 bp；泳道3為以OnPRR7-2為模板，以OnPRR7-2-F和OnPRR7-R為引物的擴增產物，產物大小89 bp；泳道4為以OnPRR7-2為模板，以OnPRR7-1-F-Q和OnPRR7-R-Q為引物的擴增產物，產物大小為118 bp。結果表明OnPRR7-1和OnPRR7-2相似性很高但是也存在差異，說明是2個不同的序列。

2.3 文心蘭OnPRR7-1和OnPRR7-2基因的生物信息學分析

測序表明OnPRR7-1和OnPRR7-2存在很小的差異，其中OnPRR7-2比OnPRR7-1多60 bp左右的核苷酸序列。理化性質分析表明，OnPRR7-1編碼的蛋白分子式為C3246H5190N1010O1064S28，分子量76 286.72，等電點是7.92，經預測該蛋白是一種不穩定蛋白。在氨基酸組成上是負電荷殘基（Asp+Glu）總數為80個，正電荷殘基（Arg+Lys）總數為82個。OnPRR7-1蛋白是一種親水性蛋白，經跨膜結構域預測可知，OnPRR7-1蛋白沒有明顯的跨膜結構域，因此它可能不是膜蛋白。OnPRR7-2編碼的蛋白分子式為C3338H5341N1039O1098S27，分子量為78 462.05，等電點是8.13，經預測該蛋白也是一種不穩定的蛋白。在氨基酸組成上，負電荷殘基（Asp+Glu）總數為81個，正電荷殘基（Arg+Lys）總數為84個，OnPRR7-2同樣也是一種疏水性蛋白。經跨膜結構域預測，該蛋白同樣沒有明顯的跨膜結構，因此也不是膜蛋白。測序結果顯示，OnPRR7-1和OnPRR7-2的cDNA片段分別為2 091 bp和2 154 bp。以NCBI上的ORF開放閱讀框在線分析可知，OnPRR7-1和OnPRR7-2分別編碼696個氨基酸（圖3）和717個氨基酸（圖4）。

經二級結構預測可知，OnPRR7-1編碼的蛋白二級結構主要包含28.30% α螺旋，16.95% β片層，47.13%無規則卷曲；OnPRR7-2編碼的蛋白主要包含27.34% α螺旋，17.29% β片層，46.86%無規則卷曲；其中均是以無規則卷曲含量最多。用Swiss-model分析OnPRR7-1的三級結構（圖5）和OnPRR7-2蛋白的三級結構（圖6），結果顯示2個基因表達的蛋白均與一種趨化蛋白CheY有25%左右的相似性，相似度并不高。

用DNAMAN將OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白的氨基酸序列與其他9個物種的PRR7蛋白氨基酸序列進行同源序列比對，比對結果如圖7所示。其他9個物種的蛋白分別是：海棗PRR37（Phoenix dactylifera，XP_008789022.1）、菡萏PRR37（Nelumbo nucifera，XP_010253458.1）、葡萄PRR37（Vitis vinifera，XP_010658157.1）、油棕PRR37（Elaeis guineensis，XP_010920961.1）、蓖麻PRR37（Ricinus communis，XP_01557-838?0.1）、鳳梨PRR37（Ananas comosus，XP_020?10???8?3???7???8.1）、巴旦木APRR7（Prunus persica，XP_0?20?4?2??3049.1）、小蘭嶼蝴蝶蘭PRR73（Phalaenopsis e?q????ue?stris，XP_020600189.1）和鐵皮石斛PRR73（D?e?n??drob??ium catenatum，XP_020692445.1）。比對結果顯示，分析的10個物種的氨基酸序列均在N末端有非常保守的RLD結構域，C末端有非常保守的CCT結構域。

2.4 OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白系統進化分析

為研究OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白的進化關系，用MEGA 6.0軟件將OnPRR7-1和OnPRR7-2

及其同源的其他植物的PRR調控因子構建系統發育樹（圖8）。共同構建系統發育樹的其他PRR調控因子分別是：巴旦木APRR7（Prunus? persica XP_020423049.1）、花生APRR7（Arachis ??????ipaensis XP_016183324.1）、苦瓜APRR7（Momordica charantia XP_022143922.1）、榴蓮APRR7（Durio zibethinus XP_022745742.1）、菡萏PRR3/7（Nelumbo nucifera XP_01025345?8.1）、桑樹PRR（Morus notabilis XP_01011231?8.1）??、番茄PRR3/7（Solanum lycopersicum XP_0??04237??533.1）、葡萄PRR3/7（Vitis vinifera XP_010658157.1）、蓖麻PRR3/7（Ricinus communis XP_015578380.1）、棗PRR3/7（Ziziphus jujuba XP_015877113.1）、大桉PRR3/7（Eucalyptus grandis XP_010067243.1）、可可子PRR3/7（Theobroma ?cacao XP_007009669.2）、鐵皮石斛PRR7/3（Dendrobium catenatum XP_0206924?45.1）、小蘭嶼蝴蝶蘭PRR7/3（Phalaenopsis equestris XP_02060?0189.1）、野生稻PRR7/3（Oryza brachyantha XP_00?664???9884.1）、玉米 PRR7/3（Zeas ACG24234.1）、鳳梨PRR3/7（Ananas comosus XP_020108378.1）、石刁柏PRR7/3（As?par?agus officinalis XP_020271482.1）、茳芏PR?R7/3?（Musa acuminata subsp.malaccensis XP_0?09??3865?43.1）、海棗PRR3/7（Phoenix dactylifera XP_008789022.1）、油棕PRR3/7（Elaeis guineensis XP_010920961.1）、擬南芥PRRs（Ara?bid?op??sis thaliana AED97278.1、AED90520.1、AEC10754.1、BAB13743.1、OAO90?757.1）水稻PRRs（Oryza sativa Indica BAD388?59.1、BAD388?58.1；Oryza sativa Japonica BAD?38856.1、BA?D?388?55.1）、小立碗蘚（Physcomitrella patens BAJ83829.1、BAJ83828.1、BAJ83827.1、BAJ83826.1、BAI39993.1）、鐵皮石斛PRR1（Dendrobium catenatum PKU76118.1）、深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica PKA66208.1）和作為外族的巴西安白僵菌PRR1（Beauveria bassiana PMB67668.1）。分析結果表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2與同為蘭科植物的鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭的PRR7/3親緣關系最近，并且系統發育樹的分支表明，雙子葉植物綱和單子葉植物綱的PRR蛋白分別分支成了上下兩組。

2.5 OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表達分析

通過Q-PCR可知，在連續的12L：12D處理下的48 h中OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表達變化情況如圖9所示。分析可知，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在2個連續的周期內呈現節律性表達，在12L：12D條件下，2個基因的表達峰值出現在光照后的4 h（上午10：00），谷值出現在光照前的4 h（凌晨2：00）左右。

在文心蘭花發育的8個時期（花苞期A、綻口期B、半開放期C、盛開前期D、盛開期E、衰老初期F、衰老期G和脫落干枯期H）中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表達情況如圖10所示。該基因在綻口期（B）和衰老初期（F）時期表達量達到高峰值，而在盛開前期（D）和脫落干枯期（H）表達達到低峰值。

3 討論

本研究克隆得到2個文心蘭PRR7基因：OnPRR7-1和OnPRR7-2基因，這2個PRR7基因成員的核苷酸序列僅有60 bp左右差異。序列比對表明它們與其他物種PRR基因氨基酸序列均在N端或C端有非常保守的RLD和CCT結構域。文心蘭PRR7基因存在2個成員的現象和小立碗蘚及水稻情況類似。小立碗蘚PRR7存在編碼不同的氨基酸序列的兩個成員PRR7a和PRR7b[26]，水稻粳稻和秈稻中也具有序列不同的兩基因成員PRR73和PRR37 [27]，但擬南芥中只有一個PRR7基因，這可能是由于在進化過程中基因含量和序列發生變化所致。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因含有RLD和CCT保守結構域的氨基酸序列，這與其他物種的PRRs家族基因編碼的氨基酸序列保守結構域相一致，但中間序列則差異較大。PRRs被定義為是包含有2個保守域的蛋白質，這2個結構域被1個不太保守的“可變”域分隔[8， 28]。因此，本研究克隆的2個文心蘭基因屬于PRR基因家族。發育樹的分支表明，雙子葉植物綱和單子葉植物綱的PRR蛋白分別形成親緣關系較遠的兩組，而OnPRR7-1和OnPRR7-2與同為蘭科植物的鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭的PRR7/3親緣關系最近。顯然文心蘭PRR基因在進化上也與其他物種的同族基因一樣具有保守性[29-30]。

表達分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在文心蘭花瓣中呈現連續的晝夜循環表達。在12L：12D光照黑暗循環處理下，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因呈現節律性表達，和之前研究的擬南芥和菁蕪菁PRRs基因的表達模式相一致[31-32]。擬南芥PRR7與PRR9和PRR5通過對CCA1和LHY啟動子的阻遏活性而在生物鐘反饋環路中發揮功能[7]，PRR7本身也通過轉錄和轉錄后機制而受到調控[33]。有研究表明擬南芥PRR7與PRR9和PRR5一起通過CONSTANS依賴性途徑控制開花時間[34]。本研究中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在文心蘭花發育和花衰老過程中呈現雙峰表達模式，表達量分別在綻口期（B）和衰老初期（F）達到高峰值，而在兩峰之間的盛開前期（D）處于低峰。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因這種表達模式，表明它們有可能在花發育的開花和花衰老的過程中發揮作用，但仍待進一步證實。

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