茄子Enhanced disease susceptibility 1互作蛋白的初步篩選與分析

肖熙鷗　林文秋　李可　馮雪峰　李威　鄒華芬　金輝

摘 要 前期研究表明，茄子Enhanced disease susceptibility 1（SmEDS1）正調控茄子青枯病抗性，但是其抗病機理有待進一步研究。為篩選SmEDS1的互作蛋白，本研究構建pGBK7-SmEDS1誘餌載體，并利用酵母雙雜交技術對相應的均一化cDNA酵母文庫進行篩選。從2次獨立的實驗中篩選到9個克隆，其非冗余地編碼6種蛋白，即TCP轉錄因子、DNAJ分子伴侶、SnRK1蛋白α亞基、氰酸酯酶、CIP4蛋白和1個未知蛋白。基于這些蛋白的功能，推測SmEDS1可能通過與本研究篩選到TCP轉錄因子互作調控水楊酸的合成，進而調控茄子的青枯病抗性。

關鍵詞 茄子；EDS1；互作蛋白；青枯病

中圖分類號 S436.411 文獻標識碼 A

Abstract In our previous study， EDS1 of eggplant （SmEDS1） was found positively regulating the bacterial wilt resistance， but the resistance mechanism was not known. To screen the candidate interactors of SmEDS1， the bait protein vector of pGBK7-SmEDS1 was construct to screen the cDNA library by Y2H. The result showed that total nine clones were obtained by two independent experiments. The nine clones encode six proteins including TCP transcriptional factor， DNAJ molecular chaperone， cyanate hydratase， CONSTANS interacting protein 4 and an unknown protein. Based on the known function of the candidate protein， SmEDS1 interacted with the TCP， which regulating the synthesis of salicylic acid and finally regulating the bacterial resistance.

Keywords eggplant； EDS1； interacted protein； bacterial wilt

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.016

EDS1廣泛存在于植物中，已從多種植物中如擬南芥、水稻、大豆、葡萄等得到克隆[1]。已有的研究表明，EDS1具有保守的結構域，其蛋白結構可以明顯的分為N段的LP結構域和C段的EP結構域，并且LP和EP結構域在EDS1與PAD4、SAG101等互作過程中發揮著重要的作用[1]。

EDS1在植物的抗病過程中發揮著重要的作用，是水楊酸抗病途徑中的重要因子，其能調控水楊酸合成基因ICS1和水楊酸下游信號基因的表達[2]。在已有的模型中，EDS1處于水楊酸合成的上游，然而其調控水楊酸合成機理尚不清晰[3]。在EDS1介導的抗病防衛反應中，EDS1主要通過與其他蛋白的互作來調控植物的抗病性。PAD4

是第一個被鑒定出與EDS1存在互作的蛋白[4]。EDS1通過與PAD4的互作激發植物的HR反應進而限制病原菌的繁殖[4-5]，并且越來越多的實驗證明，EDS1抗病功能的發揮必須要PAD4的參與[6-7]。同時EDS1還能夠與家族內另一成員SAG101產生互作[1]，并且能夠形成EDS1-PAD4- SAG101三復合體[5]。PAD4、SAG101與EDS1的互作功能之一是通過調節EDS1在細胞核和細胞質中的分布平衡激活抗病相關基因的表達/生理過程[5]。除了能與PAD4、SAG101互作外，EDS1能夠與Avr直接互作，如AvrRps4、HoPA1[8-9]或者直接與RPS4、RPS6、SNC1等R蛋白互作，接受來自R蛋白的信號激活下游的抗病反應[8-9]。

在前期研究中，我們克隆了茄子的SmEDS1，并且通過VIGS技術證明其正調控茄子的青枯病抗性[10]，然而其抗病機理未知。因此，本研究通過構建pGBK7-SmEDS1誘餌載體，篩選我們前期構建的感染青枯病病原菌R. solanacearum的茄子酵母雙雜交文庫[11]，以期獲得與SmEDS1互作的蛋白，為解析SmEDS1抗青枯病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用Clotech公司的酵母雙雜交系統。誘餌載體為pGBK7載體。酵母雙雜交文庫為我們前期構建的感染青枯病病原菌R. solanacearum的茄子酵母雙雜交文庫[11]。

1.2 方法

1.2.1 pGBK7-SmEDS1誘餌載體的構建 根據SmEDS1的cDNA序列[10]分別在其兩端添加Sfi I的酶切位點序列設計引物，用于擴增SmEDS1基因的cDNA片段，引物序列如下：SmEDS1-F：aaGGCC??ATTAC GGCCATGGTGAGAATAGGAG?AGGGTA；SmEDS1-R：ccGGCCGAGGCGGCC-CTAAATATTAATTCGCCCCGA。以cDNA為模板，利用全式金TransStart FastPfu DNA Polymerase克隆目的片段，并將其純化回收。將目的片段和pGBK7載體利用Sfi I（Fermentas 公司）酶切，然后切膠回收。將回收的目的片段和載體利用DNA Ligation Kit（TOYOBO公司）進行連接，然后用熱激法轉化大腸桿菌，過夜培養。隨機挑取5個大腸桿菌轉化子進行PCR檢測，并對擴增得到陽性條帶的克隆進行質粒抽提和測序。插入片段測序結果經比對確認正確后，進行后續實驗。

1.2.2 pGBK7-SmEDS1自激活檢測 pGBK7- SmEDS1自激活檢測參考Clotech的操作手冊。將載體按照表1的組合導入酵母AH109菌株中，進行自激活檢測。

1.2.3 文庫篩選 文庫篩選參考Clotech的操作手冊。

1.2.4 互作蛋白生物信息學分析 將得到的克隆提取質粒、測序。并將得到的數據在茄子基因數據庫（http：//eggplant. kazusa.or.jp/index.html）和NCBI數據庫中進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 pGBK7-SmEDS1誘餌載體的構建

PCR產物經過電泳檢測得到約2 000 bp大小的片段（圖1）。將PCR產物直接進行測序分析，確認該片段為目的片段。將經過過夜培養的菌落，

隨機挑選5個進行PCR檢測。結果表明，5個菌落均有約2 000 bp大小的片段（圖2），為進一步確認載體是否構建成功，挑取1號菌液提取質粒進行測序分析，測序結果表明pGBK7-SmEDS1誘餌載體構建成功。

2.2 pGBK7-SmEDS1無自激活作用

pGBK7-SmEDS1，pGADT7-LargeT/pGBKT7- p53 和pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC在SD-TL缺陷平板上都能正常生長，而僅有陽性對照（pGA- DT7-largeT+pGBKT7-p53）可在SD-TLHA缺陷平板生長（圖3）。pGBKT7-SmEDS1+pGADT7轉化子中隨機挑選的6個菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生長，生長狀態同陰性對照，LacZ檢測結果也與陰性對照相同。因此，研究結果表明pGBK7-SmEDS1無自激活作用。

2.3 互作蛋白分析

本研究第一次文庫篩選得到的5個初始陽性克隆中1、3和4號菌落能通過ADE2和HIS3報告基因的檢測，而2和5號菌落未能通過ADE2和HIS3報告基因檢測。而在第二次文庫篩選中得到了13個初始陽性克隆，12、13、15、16、17和18共6個菌落通過了ADE2和HIS3報告基因的檢測（圖4）。因此在本研究中，共得到了與SmEDS1互作的9個克隆。將9個克隆提取質粒，進行測序比對分析，共編碼6種蛋白（表2）。4、12和13號克隆分別各編碼一種蛋白，而1和3、15和18、16和17分別編碼一種蛋白。

3 討論

SmEDS1在茄子青枯病抗性中發揮著重要的作用。茄子感抗材料接種青枯病病原菌R.solanac-earum后，SmEDS1的表達量均上升，且其在抗病材料的表達量高于感病材料[12]。進一步的研究表明，SmEDS1正調控茄子青枯病抗性，并且能夠影響水楊酸途徑中的其他信號基因的表達[10]。為進一步研究其抗病機理，本研究利用酵母雙雜交手段篩選到6個與其互作的蛋白。

TCP是植物特有的轉錄因子，其在植物的抗病過程中發揮著重要的作用，其通過調控植物激素的合成來調控植物的抗病反應。Aster Yellows分泌的SAP11能夠與AtTCP1和AtTCP2發生互作，并且降低AtTCP2、AtTCP4、AtTCP13、AtTCP3、AtTCP5、AtTCP10、AtTCP17和AtTCP24等8個基因的表達量，從而降低LOX2基因表達，最終抑制內源JA的合成[13]，降低植物的抗病反應。在AtTCP8與SA合成基因ICS1的啟動子直接結合，促進內源SA的合成，正調控擬南芥的抗性[14]。進一步的研究表明，AtTCP8能與WRKY，NAC等轉錄因子互作，形成復合體與ICS1的啟動子結合，調控其表達[14]。其中WRKY正調控ICS1的表達，而NAC抑制ICS1的表達[15] 。因此，在不同的條件下，TCPs與不同的轉錄因子結合，調控ICS1的表達，最終促進或者抑制SA的合成。因此，我們推斷SmEDS1可能是通過與SmTCP互作調控水楊酸的合成，進而調控茄子的青枯病抗性。

DNAJ是廣泛存在于植物細胞內的一種分子伴侶，脅迫條件下它能夠保護細胞內蛋白質等結構的穩定性。李廣存等[16]從富集青枯病抗性相關基因的cDNA文庫中篩選到了DNAJ同源蛋白，并且證明該基因同時受青枯病菌的誘導和茉莉酸的調節，可能在青枯病菌和茉莉酸脅迫下具有促使脅迫損害細胞恢復活性的功能。在茄子受到R.solanacearum脅迫后，SmEDS1可能通過與DNAJ互作來保持蛋白質的活性，進而激發抗病反應。

SnRK1通常是由具催化功能的α亞基、起調節作用的β亞基以及有活化功能的γ亞基組成的多聚體蛋白激酶[17]，在逆境條件下通過調節能量和脅迫信號響應生物與非生物脅迫[18]。SnRKs能通過活性氧以及水楊酸信號途徑調控植物對生物脅迫的防衛反應[18]。已有的報道證明EDS1除了參與水楊酸抗病信號途徑外，還參與活性氧的抗病途徑[19]。本課題組的前期研究也證明了早期活性氧的迸發正調控茄子的青枯病抗性[20]。SmEDS與alpha subunit of SnRK1的互作是否參與了這個過程有待進一步的研究。

基于上述討論，SmEDS1可能通過與本研究篩選的TCP的互作調控水楊酸的合成，進而調控茄子的青枯病抗性。而SmDNAJ可能有助于保持SmEDS1的活性，SmSnRK1可能調控SmEDS1介導的水楊酸途徑和活性氧途徑的平衡。

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