羧基化殼寡糖絡合碘CCOS—I對水稻紋枯病菌的抑制作用及機理初討

胡雪芳　田志清　梁亮　朱祥民　姜昊業　王士奎　裴海生

摘 要 為明確羧基化殼寡糖絡合碘（CCOS-I）對水稻紋枯病的防治作用，以20%井岡霉素可濕性粉劑為對照藥劑，測定CCOS-I對水稻紋枯病菌的室內抑菌效果和田間防效，以及對超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、葉片過氧化物酶（peroridase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase）等相關防御酶活性的影響。結果表明：羧基化殼寡糖絡合碘對該病菌抑制效果明顯，經室內毒力測定，其EC50值12.22 mg/L，明顯高于對照藥劑20%井岡霉素粉劑。田間藥效試驗結果表明，在水稻第3次用藥后14 d，100 g/hm2的羧基化殼寡糖絡合碘防效達到80.66%，與井岡霉素有效劑量150 g/hm2的效果相當，優于同劑量井岡霉素處理。CCOS-I在試驗劑量范圍內對水稻紋枯病有很好的防治作用，且對水稻生長無任何藥害現在發生，可以誘導水稻相關防御酶活性提高，適用于水稻紋枯病的防治，具有一定的開發推廣價值。

關鍵詞 水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）；羧基化殼寡糖絡合碘（CCOS-I）；抑菌作用；防御酶；防治效果

中圖分類號 S482.2 文獻標識碼 A

Abstract In order to clarify the preventive and therapeutic effects on rice sheath blight， 20% validamycin wettable powder as the control， the antibacterial effect of carboxylated chitosan oligosaccharide iodine complex （CCOS-I） on R.solani in a greenhouse and its efficacy in the paddy field were assayed. And the induced activity of CCOS-I on the peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD）， polyphenol oxidase （PPO）， phenylalnaine ammonia-lyase （PAL） and beta-1，3-glucanase （beta-1，3-glucanase） were studied. CCOS-I had a significant inhibitory effect on R. solani， and its EC50 value was 12.22 mg/L， which was obviously higher than that of the control in the field trial test， The control effect of CCOS-I at the effective dose of 100 g/hm2 was 80.66%，which was equivalent to the valid dose of validamycin 150 g/hm2 and better than the same dose of validamycin，after the third spraying 14 d. Compared with the spraying control agent， CCOS-I not only had good control effect on rice sheath blight， but also had a certain promoting effect on rice growth. CCOS-I induced rice resistance against R. solani which related to the increased activities of defense enzymes caused by CCOS-I. CCOS-I was safe for rice and had a certain value of development and promotion.

Keywords rice sheath blight （Rhizoctonia solani）； carboxyl chitosan oligosaccharide complex iodine （CCOS-I）； antimicrobial activity； defense enzymes； control effect

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.018

水稻紋枯病是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的一種水稻真菌病害，多在高溫、高濕環境下發生，在南方稻區尤為嚴重，是當前水稻生產上的主要病害之一[1]，紋枯病可造成水稻谷粒不飽滿，空殼率增加甚至引起植株倒伏枯死，造成水稻減產10%～50%以上[2]。針對水稻紋枯病，國內外開展了室內及田間藥效試驗研究[3-10]。目前，生產上用于防治紋枯病的化學藥劑主要有噻氟酰胺、三唑酮、苯醚·丙環唑、多菌靈、甲基硫菌靈等[11-12]。然而，隨著這些殺菌劑的高頻率、單一性、連續性使用，使得立枯絲核菌產生了抗藥性，從而導致防治效果下降。同時，由于化學農藥存在藥物殘留、難以降解、危害環境等問題，近年來，針對水稻紋枯病的生物農藥由于具有安全性高、環境相容性好等優點而成為廣大科研工作者的研究熱點。

殼寡糖（COS）是殼聚糖經過降解以后得到的聚合度為2～20的產物，作為一種激發子，可以成為植物細胞的信號分子，刺激植物免疫系統，激活防御反應，促使植物產生抗病害的活性物質抑制病害，并促進植物生長[13-14]。但是由于其作用表達過程較慢，從開始噴施到農藥殺死或擊倒靶標有害生物所需時間的較長，速效性差，影響了寡糖類農藥產業發展的步伐。羧基化殼寡糖是殼寡糖分子第六位羥基羧基化后生成的一種寡糖衍生物，分子中含有豐富的-OH、-NH2和-COOH基團，除具有殼寡糖相似生理功能外，還能有效提高殼寡糖絡合能力，利用該分子特性，與具有較強殺菌能力的碘元素形成穩定的絡合體系，制備出羧基殼寡糖絡合碘，以期充分發揮寡糖植物生理調節、誘導植物產生抗病抗逆性等防衛反應功能以及碘元素對植物病原菌的速殺作用，羧基化殼寡糖絡合碘（CCOS-I）作為本實驗室研發的新型抗菌制劑，還沒有將其應用于水稻紋枯病的報道，本研究通過室內盆栽實驗及田間藥效試驗，評價其對水稻紋枯病的抑制作用及相關防御酶活性的影響，為寡糖衍生物藥劑的研究、開發和應用開拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑 殼寡糖絡合碘（CCOS-I），由上海貫發海洋生物科技有限公司提供；20%井岡霉素粉劑，由上海源葉生物科技有限公司提供。

1.1.2 供試菌株 立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），由中國農業大學植物病理學系提供。

1.1.3 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基制備：馬鈴薯200 g去皮切塊，加1 000 mL無菌水煮沸30 min，用八層紗布過濾，加入瓊脂15 g，加熱攪拌混勻，待瓊脂完全溶解后，加入葡萄糖20 g融化后，稍冷卻后補足無菌水至1 000 mL，分裝于試管中滅菌（121 ℃，20 min），冷卻后貯存備用。

含藥培養基平板的制備：吸取1 mL各個質量濃度的藥液，與PDA培養基以1：9比例混勻后分別倒入5個培養皿內，制成系列質量濃度的含藥培養基（CCOS-I質量分數分別為120、60、30、15、7.5 mg/L；井岡霉素質量分數為：120、60、30、15、7.5 mg/L），同時設置不含藥平板作空白對照，每處理重復3次。

1.1.4 主要儀器 124S-CW電子天平，德國Satorious公司；ZGZ-L光照培養箱，上海丙林電子科技有限公司；新加坡“利農牌”DF400型可控壓手動噴霧器。

1.2 方法

1.2.1 CCOS-I對立枯絲核菌菌絲生長的影響[15]

無菌條件下用直徑5 mm的滅菌打孔器沿已培養好的菌落邊緣切取菌餅，用無菌接種器將菌餅接種于不同處理培養基平板的中央，有菌絲一面朝下，置于25 ℃下暗培養10 d，待對照菌落直徑長至大于平皿直徑2/3時，用卡尺測量菌落直徑（mm）。每個菌落用十字交叉法垂直測量直徑各1次，取其平均值。與對照比較計算各藥劑處理對菌落擴展的生長抑制率。以藥劑質量濃度的對數值為橫坐標、菌絲生長抑制率的幾率值為縱坐標，采用回歸分析法對試驗數據進行分析，計算各處理的EC50值。

菌絲生長抑制率（%）=

1.2.2 CCOS-I對立枯絲核菌菌核形成及萌發的影響 參照張建中等[16]的方法，略有改動。將PDA培養基上培養的立枯絲核菌打成菌餅（d= 5 mm），分別接種在含藥培養基（CCOS-I質量分數和井岡霉素質量分數分別為120、60、30、15、7.5、0 mg/L）系列濃度的PDA平板上，25 ℃黑暗培養30 d，菌核變褐成熟時用鑷子挑出收集，烘干，稱重。每處理重復3 次，計算不同濃度藥劑對菌核形成的抑制率。將立枯絲核菌在PDA平板上培養的成熟菌核浸漬在分別含CCOS-I和井岡霉素120、60、30、15、7.5、0 mg/L系列濃度的溶液中30 s，風干后置于PDA平板上，25 ℃培養。觀察不同處理的菌核萌發情況，實驗分別重復3次，每個重復測定60個菌核。

1.2.3 殼寡糖對水稻相關防衛酶活性變化的影響

1.2.2節中篩選出的CCOS-I最佳濃度噴霧處理成株期水稻植株，24 h后在噴藥植株上采用噴霧法接種孢子濃度為105 CFU/mL的立枯絲核菌。試驗設有3個處理：（1）噴施最優藥劑后接種；（2）噴施相同劑量井岡霉素后接種；（3）噴灑無菌水后接種，每個處理3次重復。于接種后第0、1、2、3、4、5 d分別采收處理葉片樣品，裝入錫箔紙中，做好標記，在–80 ℃冰箱中保存備用。

POD活性測定：采用武彥霞等[17]的方法，以1 min內引起OD470、OD290變化0.01的酶量為1個酶活性單位。PPO活性測定：參照王小青等[18]的方法，以OD490值變化0.01為1個酶活單位。SOD酶活性測定：參照蕭浪濤[19]的方法，略有修改；以1 h內引起OD560值變化0.01為1個酶活單位。PAL酶活性測定：參考肖仲久等[20]方法，以1 h內引起OD290變化0.01為1個酶活性單位。β-1，3-葡聚糖酶活性測定：參考Joostem等[21]的方法，以1 h生成1 μg的葡萄糖為1個酶活性單位。

1.2.4 田間藥效試驗 2015年8—10月在福建省龍巖市上杭縣臨城鎮龍翔村進行，該地區常年水稻紋枯病發生較重。試驗地為壤質土，有機質含量一般。供試水稻品種為廣兩優676。以行距20 cm，株距20 cm種植，正常肥水管理.實驗藥劑處理設置為：CCOS-I制劑有效劑量為50、100、150 g/hm2，對照藥劑20%井岡霉素水溶性粉劑有效劑量為150 g/hm2和清水對照共5個處理，每個處理重復4 次，共20個小區，小區面積為20 m2，隨機區組排列。每個小區四周設保護行，避免施藥時藥劑相互干擾。于水稻分蘗末期第1 次用藥，間隔20 d，在水稻破口前第2次用藥，間隔10 d后在水稻齊穗期第3 次用藥，每次用藥量為750 L/hm2。試驗期間不再噴施其他藥劑，其他按常規進行田間管理。分別于第2、3 次用藥后14 d，每小區隨機五點取樣200株水稻，調查病情，計算病情指數和防效。

水稻紋枯病病情分級參照《農藥田間藥效試驗準則》[22]進行調查，并計算病情指數，和防治效果。

1.3 數據統計

采用Excel軟件統計病情指數，采用DPS 7.05軟件計算藥劑對立枯絲核菌菌絲生長、孢子萌發及芽管伸長的毒力回歸方程、EC50值。田間藥效試驗數據采用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 CCOS-I菌絲生長的影響

CCOS-I和井岡霉素抑制立枯絲核菌菌株的回歸方程及EC50值見表1。結果表明，CCOS-I對水稻紋枯病菌菌絲具有明顯的抑制活性，其EC50值為12.22 mg/L，毒力高于對照藥劑井岡霉素。

2.2 CCOS-I對立枯絲核菌菌核形成及其萌發的影響

在7.5～60 mg/L劑量范圍內，CCOS-I對菌核形成的抑制作用隨藥劑濃度的升高而增強，分別高出相同劑量井岡霉素處理的56.52%、25.98%、18.84%、8.33%（圖1），其中60 mg/L劑量CCOS-I對立枯絲核菌菌核產量抑制效果最為明顯，抑制率達到71%，當濃度增加到120 mg/L，其菌絲生長抑制率有所下降，但與60 mg/L劑量處理效果差異不顯著（p>0.05）。經觀察，菌核經CCOS-I處理后，與對照相比，菌核萌發受到一定影響，菌絲的生長受到明顯抑制。

2.3 CCOS-I對水稻相關防衛酶活性變化的影響

（1）SOD活性變化：不同處理后水稻葉片中SOD活性變化測定結果表明，在整個取樣時間

內，CCOS-I處理葉片的SOD活性均高于井岡霉素和CK處理（圖2-A）。處理后2 d，接種葉片中SOD含量達到峰值，比同劑量井岡霉素處理高出36.75%，比CK處理高出47.60%。

（2）POD活性變化：不同處理后水稻葉片中POD活性變化測定結果表明，CCOS-I和井岡霉素處理均可顯著提高接種水稻葉片POD酶活性，且在處理24 h后SOD含量達到峰值，CCOS-I處理葉片中PPO酶活性分別高出井岡霉素和CK處理20.46%和32.61%（圖2-B）。

（3）PPO活性變化：由圖2-C可以看出，經CCOS-I處理葉片后，PPO活性明顯高于井岡霉素和CK處理，在接種后24 h達到峰值，比井岡霉素和CK處理提前了1 d。且其最大值分別高出井岡霉素和CK處理24.01%和43.75%。

（4）PAL活性變化：由圖2-D可以看出，經CCOS-I處理后的PAL酶活性迅速上升，且整個測定期內CCOS-I處理的水稻葉片PAL酶活性均高于兩個對照處理，CCOS-I和井岡霉素處理在接種后的第1 d、第3 d呈現兩個高峰，其中CCOS-I處理的2個高峰值分別高于井岡霉素處理24.42%和19.18%，而CK處理在接種后0～5 d內PAL酶活性變化不明顯。

（5）β-1，3-葡聚糖酶活性變化：不同處理后水稻葉片中β-1，3-葡聚糖酶活性變化測定結果表明，處理期間CCOS-I對其影響最為顯著，在接種處理后第3 d達到高峰值，其活性高于井岡霉素處理13.55%，而CK處理β-1，3葡聚糖酶活性變化相對穩定，始終低于CCOS-I和井岡霉素處理（圖2-E）。

2.3 藥劑的田間試驗效果

由表2可以看出，CCOS-I對水稻紋枯病具有很好的防治效果，且具有一定的量效關系，隨著寡聚酸碘濃度的升高，對水稻紋枯病的防治效果明顯升高。在水稻第3次用藥后14 d，100 g/hm2的CCOS-I防效達到各處理對水稻紋枯病的防治達到80.66%，與井岡霉素有效劑量150 g/hm2的效果相當，無顯著性差異（p>0.05）。

2.4 CCOS-I的安全性調查

在3次施藥后，觀察水稻植株的生長狀況，結果顯示，CCOS-I制劑在有效劑量為50、100、150 g/hm2劑量下，各小區供試水稻植株對CCOS-I表現出較強的耐藥性，生長正常，無藥害發生。表明CCOS-I在所試各藥量下對水稻生產安全。且CCOS-I稀釋液各劑量處理與井岡霉素和清水對照相比，水稻生長性狀良好，長勢旺盛。表明CCOS-I在適當的施藥條件下，不僅對水稻紋枯病具有良好的防治效果，且可一定程度上促進水稻生長。

3 討論

CCOS-I作為新型殼低聚糖基配合物，屬于生物源類農藥，存在多種活性功能基團如-OH、-NH2、-COOH、碘離子等，可協同發揮抑菌及誘導植物抗病等防衛反應作用，本研究通過帶毒培養基-菌絲生長速率法測定其對水稻紋枯病病菌的抑制效果，結果表明，（1）CCOS-I對該病菌抑制效果明顯，經室內毒力測定，其EC50值12.22 mg/L，明顯高于對照藥劑20%井岡霉素粉劑，且CCOS-I處理對立枯絲核菌菌核形成具有強烈的抑制效果，同時對其萌發也有一定的抑制作用；而丙環唑等傳統藥劑對立枯絲核菌菌核萌發無抑制作用[12]，殼寡糖對水稻菌核形成和菌絲萌發均無抑制作用[23]，由此推斷，可能是CCOS-I中的碘

元素在抑制立枯絲核菌菌核形成和萌發方面起著重要作用，但其機理有待進一步的研究。（2）大量研究表明，寡糖及寡糖衍生物可誘導SOD、PPO、POD、PAL以及β-1，3-葡聚糖酶等植物體內重要防御酶的活性[24-28]。本研究結果表明，經CCOS-I處理后，水稻植株體內SOD、PPD、POD、PAL和β-1，3-葡聚糖酶活性均有明顯增加，且效果優于井岡霉素和CK處理。而以上幾種酶等作為植物體重要的防御酶類在提高植物抗逆性、抗病性方面起著重要作用[29-31]，因此推測，CCOS-I中的殼寡糖醛酸基，本身作為殼寡糖衍生物，可誘導植物這一系列酶活性的提高，而這可能是其生物防治作用的機制之一。（3）田間藥效試驗結果表明，在水稻第3次用藥后14 d，100 g/hm2的CCOS-I對水稻紋枯病的防治達到80.66%，與井岡霉素有效劑量150 g/hm2的效果相當，優于同劑量井岡霉素處理，對紋枯病具有良好的治療效果。科學地掌握藥劑使用時間，可以有效預防水稻紋枯病的發生、促進水稻生長、且該制劑對環境污染小，安全、高效，是防治水稻紋枯病的良好藥劑。

致 謝 感謝福建省農業科學院植物保護研究所的陳福如老師在田間藥效試驗中的指導和幫助。

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