轉基因番木瓜55—1轉化事件定性PCR檢測方法的建立

王恒波 肖乃衍 張華 陳平華

摘 要 為了防止國外商業化生產的轉基因番木瓜流入國內市場，建立轉基因番木瓜55-1轉化事件定性PCR檢測方法，對于保護國內消費者知情權意義重大。本研究以轉基因抗環斑病毒番木瓜55-1為研究材料，利用外源基因和番木瓜基因組序列設計了9對特異性檢測引物，通過特異性引物篩選、熔解曲線分析、退火溫度優化、特異性驗證、靈敏度分析及檢測限驗證，建立轉基因番木瓜55-1轉化事件定性PCR檢測方法。結果表明：本研究篩選出的檢測引物，可特異的檢出轉基因番木瓜55-1轉化事件，引物的檢測靈敏度達到了0.1%的標準，高于歐盟0.9%的檢測要求，完全可滿足轉基因檢測標識制度的順利實施。

關鍵詞 番木瓜；轉基因；定性PCR；檢測

中圖分類號 S432.42 文獻標識碼 A

Abstract Transgenic papaya 55-1， which has been marketed in America for many years， is a genetically modified organism not currently approved for food in China. The paper aimed to establish a qualitative PCR detection method for transgenic papaya line 55-1 and its derivative products for preventing foreign transgenic papaya products into the Chinese market. Based on the exogenous gene and the papaya genome sequence， nine pairs of specific primers were designed with transgenic papaya 55-1 as the research material， using specific primer screening， melting curve analysis and optimization of annealing temperature， specific validation， sensitivity analysis and detection limit verification. The method of transgenic papaya 55-1 and it's derivates was established with qualitative PCR detection. The resulted showed that the screened primers， which could specialize to detect the transgenic papaya line 55-1， could reach 0.1% and the detection sensitivity of primers was higher than the requirements of the detection of EU 0.9%. The method of this paper would provide a scientific and reasonable experiment reference for validating the composition of genetic modified organisms in the future in China.

Keywords papaya； transgenic； qualitative PCR； detection

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.011

番木瓜（Carica papaya L.）又稱木瓜，原產南美洲，現階段主要分布于熱帶和亞熱帶地區。因其果實厚實，果肉甜美可口，同時富含維生素C，其青果中的木瓜蛋白酶可用于醫藥、食品和化妝品等領域，但是由于番木瓜易受番木瓜環斑病毒（Papaya ring spot virus， PRSV）的侵襲，該病害為番木瓜的一種世界性毀滅性病害，一旦植株受到侵染，便很難防治，即使通過清除病株、應用殺蟲劑防治昆蟲傳播病毒措施均很難有效控制病害[1]。我國華南地區田間病害發病率一般都達到30%以上，該病毒會引起番木瓜植株矮縮、葉片斑駁、含糖量降低，使其產業受到嚴重的威脅，甚至出現絕收[2]。由于番木瓜栽培種中缺乏抗性資源，而野生番木瓜中的抗性基因通過常規雜交育種又很難轉入番木瓜栽培種[3]，目前，世界各國育種者通過常規雜交育種方法均未獲得滿意的抗病品種。1987年美國康奈爾大學、夏威夷大學同Up John公司合作[4]，將PRSV HA5-1株系的外殼蛋白基因轉入番木瓜中，培育出對PRSV具有抗性的轉基因番木瓜55-1品系，商業名稱Sunup和Rainbow[5]，田間實驗表現優良。1997年番木瓜55-1通過美國農業部、環保局及食品藥品監管局的批準，1998年5月起在夏威夷正式投入商業化生產[6]，這種抗病毒轉基因番木瓜極大地振興了夏威夷的番木瓜產業[7]。因此，將轉基因技術應用于番木瓜的研究，對于保障番木瓜產業的健康、可持續發展具有重要意義。

近年來，特別是國內由于食品安全事件層出不窮，引發了廣大消費者對轉基因生物食品安全的憂慮與擔心，為了保護消費者的知情權與選擇權，世界上多個國家與地區都對轉基因生物食品實施標識管理。加之，由于我國對轉基因產品實行強制標識制度，為了標識制度的順利執行，轉基因生物及產品的檢測標準的建立也應該緊跟轉基因生物產品商業化生產的步伐。目前已經建立轉化體特異性檢測方法的轉基因轉化體包括MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MON513、MON1445等[8-15]。

我國對轉基因產品實行強制標識制度，但目前為止，全世界獲準商業化生產的抗病毒轉基因番木瓜有5種（Event 55- 1、Event 63- 1、X17- 2、華農一號、YK系列）。但是針對上述轉化事件的檢測方法中，對于轉基因番木瓜定性PCR檢測引物篩選方法未見詳細介紹，為了加強對我國政府部門，對市場上流通的番木瓜進行轉基因成分進行監測，維護消費者知情權，迫切需要建立適合轉基因番木瓜定性PCR檢測引物篩選方法。本研究根據GenBank公布的轉基因番木瓜55-1所有的轉化載體邊界序列與番木瓜基因組序列，設計了9對轉化事件特異性引物，通過引物特異性、熔解曲線、退火溫度、靈敏度等方面進行定性PCR檢測。因此，本研究建立的引物的篩選方法，期望為以后其他作物轉基因檢測體系的建立，提供一個標準引物篩選程序。同時，本研究建立的檢測方法適用于含有轉基因番木瓜55-1及其衍生產品的檢測，為其檢測標準的制定提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 轉基因番木瓜55-1種子（由福建農林大學郭晉隆副研究員提供），為了證實該種子的準確性，本研究依據韓建勛等[16]的檢測方法，進一步進行驗證，PCR產物經過測序、比對發現與GenBank公布的轉基因番木瓜55-1序列100%同源。轉基因番木瓜55-1含量為5%、1%、0.5%、0.1%的標準品DNA是通過相同含量轉基因番木瓜DNA和非轉基因番木瓜紅妃2號，按質量比（w/w）混合制成，轉基因番木瓜16-0-1、“華農一號”、紅妃2號（非轉基因番木瓜），轉基因水稻科豐6號、TT51-1，轉基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、A5547-127和轉基因玉米MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MIR604、MIR612等19種，為本實驗室保存。

1.1.2 試劑和儀器 PCR反應試劑FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）購自廈門鷺隆生物科技有限公司，ExTaq酶、dNTPs、buffer購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司，100 bp Ladder DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司。Centrifuge 5810R臺式離心機（美國），ΜLtrospec2100核酸蛋白分析儀（日本），Mastercycler EP PCR熱循環儀（德國），ABI公司7500定量PCR儀（美國），EPS301電泳儀（瑞典），BIO-RAD公司凝膠成像系統（美國）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI公布的轉基因番木瓜55-1所用的轉化載體邊界序列與番木瓜基因組序列（GenBank no. FJ467933），采用Primer Premier 5.0軟件設計引物。番木瓜內標準基因Papain檢測引物采用Wall等[17]設計序列。具體檢測引物序列和擴增產物長度見表1。引物稀釋成10 ?mol/L備用。

1.2.2 PCR反應體系與程序 定性PCR反應體系25 μL：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，引物10 μmol/L各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，加滅菌雙蒸水18.875 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；最后72 ℃延伸7 min后，4 ℃保存備用。電泳時加入6×Loading buffer 1 μL，取6 μL擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。退火溫度的優化是在PCR上設置50～60 ℃退火溫度范圍，取10個溫度梯度，分別為50.2、50.7、51.6、52.7、54.0、55.4、56.8、58.1、59.2、60 ℃。

定量PCR反應體系：使用廈門鷺隆生物科技有限公司提供的Roche熒光定量試劑盒，按照說明書進行反應。擴增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，60 ℃ 40 s，40個循環。熔解曲線溫度范圍為65.0～95.0 ℃，每間隔0.5 ℃讀數一次，每次1 s，連續記錄熒光信號的變化，可得到產物的Tm值。每個試樣均做3次重復。

1.2.3 定量檢測引物熔解曲線分析 本研究按照定量PCR反應程序，將質量百分含量為1%的轉基因番木瓜55-1為陽性對照，進行定量PCR擴增，在相同反應條件下，通過9對引物進行相互間比較，分別于起峰時Ct值的大小、熔解曲線及熔解曲線高度等，選擇出轉基因番木瓜55-1最佳的檢測引物。

1.2.4 55-1轉化事件特異性PCR檢測 以材料中的11種轉基因植物（轉基因番木瓜YK、轉基因番木瓜RP、轉基因玉米Bt11、轉基因玉米Tc1507、轉基因玉米MON810、 轉基因玉米MON863、轉基因玉米T25、轉基因大豆A5547-127、轉基因大豆A2704-12、科豐6號、TT51-1水稻）為測試對象，以質量百分含量為1%的轉基因番木瓜55-1為陽性對照，非轉基因番木瓜紅妃2號為陰性對照，并設置空白對照。利用55-1-2引物對進行定性PCR擴增，通過電泳分析PCR產物大小，進而驗證轉基因番木瓜55-1轉化體檢測引物的特異性。

1.2.5 55-1轉化事件特異性PCR靈敏度檢測 將轉基因番木瓜55-1 的DNA與非轉基因番木瓜DNA溶液（100 ng/μL）按照不同比例混合配成相對含量為5%、1%、0.5%、0.1%的樣品，作為PCR檢測的模板，進行靈敏度測試，設置空白對照。PCR擴增初始模版濃度定為100 ng/μL，PCR反應體系和PCR擴增程序與1.2.2節相同。

1.2.6 檢出限的測試 將質量分數為0.1%的55-1番木瓜樣品，提取基因組DNA，進行多次PCR擴增，每次檢測設置2個平行PCR反應，PCR反應體系和PCR擴增程序與1.2.2節相同。

2 結果與分析

2.1 番木瓜DNA的質量驗證

高質量的DNA是PCR擴增獲得成功的前提條件。按照轉基因檢測標準規定，必須先對番木瓜的內源單拷貝基因Papain進行定性PCR檢測，以目的條帶擴增產物的有無，來判定提取的DNA是否適合進行PCR擴增，避免假陰性結果的出現。從圖1可見，所有樣品的PCR擴增產物均能獲得與預期片段211 bp相一致，陰性對照與空白對照正常，表明提取的DNA質量滿足PCR檢測要求。

2.2 引物的鑒定與篩選

為了篩選出最優組合引物對，對55-1外源基因插入位點的左右邊界共設計出9對特異性引物，用于擴增外源插入載體和番木瓜基因組連接區域的序列，擴增產物的大小均在200～400 bp之間。開始采用通用的PCR擴增條件，所用擴增模板量一致，擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，獲得了實際擴增產物與預期的擴增產物大小一致結果（圖2），除了引物對1與引物對3擴增的條帶較弱外，其余引物對都擴增出各自預期大小一致的片段，特別是引物對2、引物對6、引物對8擴增條帶很亮，說明該引物對擴增效率較高。

2.3 熔解曲線分析

由圖3可知，從9對引物各自的熔解曲線分析，只用引物對2與引物對5呈比較典型的單峰曲線，且峰值較高，說明該引物與模板結合性好，PCR擴增效率高，進而擴增產物量多，但是在隨后的品系特異性驗證過程中發現，引物對5對于非轉基因番木瓜有非特異性擴增片段。其余7對引物對都在不同程度上產生雙峰，極大地影響了PCR的擴增效率。綜合以上實驗結果，引物對2不僅特異性強，且PCR擴增效率高，為轉基因番木瓜55-1品系特異性檢測最適引物對。

2.4 特異性引物退火溫度的優化

由圖4可知，隨著退火溫度的逐漸升高，特異性引物能檢測出目的條帶，沒有非特異性條帶出現，說明該特異性檢測引物適宜的退火溫度范圍均較廣，其中6號泳道（55.4 ℃）擴增產物顯示出濃度較高、條帶較亮，即通過引物的篩選和反應條件的優化，確定了最適退火溫度為56 ℃，該退火溫度也是番木瓜內源基因Papain最適退火溫度，且兩者擴增產物大小比較接近。因此，在實際檢測過程中，可將檢測內源基因Papain和品系特異性55-1轉化事件同時進行。

2.5 轉化事件55-1特異性引物55-1-2的PCR特異性檢測

本研究選擇了多種不同轉基因植物品系，涵蓋玉米、番木瓜、水稻、大豆等作物，驗證轉基因番木瓜55-1轉化事件檢測引物的特異性。檢測結果如圖5所示，僅從轉基因番木瓜55-1品系檢測出了275 bp的目的片段，其他參試材料均未擴增出任何片段，這表明本研究建立的番木瓜55-1轉化事件檢測方法具有良好的特異性和準確性。

2.6 55-1轉化事件PCR靈敏度檢測

以4種不同相對含量的轉基因番木瓜55-1的樣品為模板，按照優化后的退火溫度56 ℃進行定性PCR擴增（圖6）。結果顯示，在含量為0.1%以上（含0.1%）的樣品中均能穩定擴增到預期DNA片段，表明方法的靈敏度可達到0.1%，完全符合轉基因檢測的要求。

2.7 檢出限的確定

為了進一步測試檢測方法的檢出限，結果如圖7所示。在48次檢測中，均能穩定檢測出275 bp的預期DNA片段，表明本標準方法的檢出限可以穩定達到為0.1%水平。

3 討論

近年來，隨著轉基因技術的逐步發展和完善，轉基因作物及制品越來越多，其相對應的檢測體系和檢測方法，尤其是指檢測引物更加多樣（分為篩選檢測引物、基因特異性檢測引物、結構特異性檢測引物和轉化事件特異性檢測引物，相應的又分為定性檢測和定量檢測引物）[18]。如何設計和篩選既適合定性PCR又適合定量PCR引物對，對于檢測者來講需要更高的技術水平。本研究所建立的引物篩選方法，以熒光染料的可視化為基礎，首先設計了多對特異性引物，其次是通過引物特異性、熔解曲線、退火溫度、靈敏度、檢出限等方面進行定性PCR檢測，并且層層篩選和驗證，最后選擇了1對特異性強、擴增效率高的檢測引物，該引物不僅適合轉基因番木瓜普通的定性PCR檢測，而且也適合定量PCR檢測。該引物的篩選方法的建立解決了許多轉基因作物檢測方法僅僅適合定性或定量檢測單一檢測目的，實現了定性和定量PCR檢測引物可以共用的目的，降低了測試成本，提高檢測效率。本研究以世界上第一個商業化種植的轉基因抗病毒番木瓜55-1為材料，篩選出的引物特異性強、靈敏度高，完全可以達到0.1%的檢測閾值，高于歐盟0.9%的標識要求，建立了適合轉化事件55-1特異性檢測的定性PCR檢測方法。

對于常規的轉基因檢測，一般選擇作物的種子為檢測對象。因為種子抽樣簡單，而且易于運輸和保存，不容易腐爛、變質。本研究在檢測番木瓜種子時，發現番木瓜種子的種皮有黑色物質，且種子堅硬，筆者曾經試圖通過研磨種子提取DNA，發現種皮的黑色物質始終存在，即使通過吸附柱過濾，將提取的基因組DNA進行PCR擴增，其中大部分DNA不能擴增出條帶，該結果與韓建勛等[16]的研究發現類似。通過浸泡種子后，將黑色種皮剝去，再進行種子研磨，提取番木瓜種子DNA都能滿足PCR擴增要求，未發現有PCR抑制物質存在。本研究改良的方法提取番木瓜種子DNA適合進行PCR擴增，不僅純度高，而且易于操作。

由于定性PCR是終點定量法，無法說明引物的擴增效率，本研究按照SYBR Green 染料法，將1%含量的轉基因番木瓜55-1 的DNA樣品進行定量PCR擴增，通過熔解曲線性狀和峰值大小，來判斷引物與模板退火是否適合。如果引物特異性強、擴增效率高， PCR擴增產物量多，溶解曲線的單一，且峰值最高[19]。這種方法常應用在熒光定量PCR的引物篩選中，但是在定性PCR檢測引物篩選中未見應用。在隨后的品系特異性驗證過程中發現，除了引物對55-1-2的特異性強和擴增效率高外，其余引物對都在不同程度上產生雙峰，極大降低了PCR的擴增效率，對于將要建立的轉基因番木瓜的國家標準而言，該引物對要經得起多種混合DNA干擾擴增出特異性的目標序列。因此，引物對55-1-2為轉基因番木瓜55-1轉化事件特異性檢測最適引物。

綜上所述，為了進一步驗證本研究建立檢測方法的準確性、特異性，通過在福州市各個水果批發市場、大型超市、小型水果商店隨機抽樣調查，共抽樣60個，進行轉基因成分檢測，檢測出的陽性樣品都是臺灣中興大學研發的GM-YK系列，由于所有抽檢樣品產地都是國內生產的番木瓜，未發現國外進口的番木瓜55-1。在隨后多次的模擬檢測中，本研究建立的定性PCR檢測方法具有很高的穩定性，能對轉基因番木瓜55-1 進行快速準確的分子鑒定。

參考文獻

[1] Manshardt R， Lius S， Sondur S， et al. Papaya breeding for PRV resistance[J]. Acta Horticulturae， 1995（370）： 27-32.

[2] 陳 健. 番木瓜栽培關鍵技術[M]. 廣州： 廣東省出版集團， 2004： 242.

[3] 饒雪琴， 李華平. 轉基因番木瓜研究進展[J]. 中國生物工程雜志， 2004， 24（6）： 38-42.

[4] Lius S， Manshardt R M， Fitch M M M， et al. Pathogen-derived resistance provides papaya with effective protection against papaya ring spot virus[J]. Molecular Breeding， 1997， 3（3）： 161-168.

[5] Fitch M M， Manshardt R M， Gonsalves D， et al. Transgenic papaya plants from Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos[J]. Plant Cell Reports， 1993， 12（5）： 245-249.

[6] Gonsalves D， Ferreira S， Manshardt R， et al. Transgenic virus resistant papaya： new hopefor controlling papaya ringspot virus in Hawaii[J]. Plant Health Progress， 2000， doi：10.1094/PHP-2000-0621-01-RV.

[7] Suzuki J Y， Tripathi S， Fermín G A， et al. Characterization of insertion sites in rainbow papaya， the first commercialized transgenic fruit crop[J]. Tropical Plant Biology， 2008， 1（3-4）： 293-309.

[8] Berdal K G， Holst-Jensen A. Roundup Ready soybean event-specific real-time quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses[J]. European Food Research & Technology， 2001， 213（6）： 432-438.

[9] Nielsen C R， Berdal K G， Holst-Jensen A. Characterisation of the 5′ integration site and development of an event-specific real-time PCR assay for NK603 maize from a

low starting copy number[J]. European Food Research & Technology， 2004， 219（4）： 421-427.

[10] Hernández M， Esteve T， Prat S， et al. Development of real-time PCR systems based on SYBR Green I， Amplifluor? and TaqMan technologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event GA21[J]. Journal of Cereal Science， 2004， 39（1）： 99-107.

[11] Hernández M， Pla M， Esteve T， et al. A Specific real-time quantitative PCR detection system for event MON810 in maize yield gard based on the 3′-transgene integration sequence[J]. Transgenic Research， 2003， 12（2）： 179-189.

[12] Huang H Y， Pan T M. Detection of genetically modified maize MON810 and NK603 by multiplex and real-time polymerase chain reaction methods[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2004， 52（11）： 3 264-3 268.

[13] Pan A， Yang L， Xu S， et al. Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of MON863 maize based upon the 3?-transgene integration sequence[J]. Journal of Cereal Science， 2006， 43（2）： 250-257.

[14] Taverniers I， Windels P， Va?tilingom M， et al. Event-specific plasmid standards and real-time PCR methods for transgenic Bt11， Bt176， and GA21 maize and transgenic GT73 canola[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2005， 53（8）： 3 041-3 052.

[15] Yang L， Xu S， Pan A， et al. Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5'-transgene integration sequence[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2005， 53（24）： 9 312-9 318.

[16] 韓建勛， 陳紅運， 鄧婷婷， 等. 抗病毒轉基因番木瓜的實時PCR檢測[J]. 檢驗檢疫學刊， 2010， 20（1）： 15-20.

[17] Wall E M， Lawrence T S， Green M J， et al. Detection and identification of transgenic virus resistant papaya and squash by multiplex PCR[J]. European Food Research & Technology， 2004， 219（1）： 90-96.

[18] 張 麗， 武玉花， 吳 剛， 等. 轉基因油菜篩查檢測策略研究[J]. 中國油料作物學報， 2012， 34（1）： 74-81.

[19] 陳如敬， 黃秋宇， 修金生， 等. 豬細環病毒k2型SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法的建立[J]. 中國動物傳染病學報， 2016（5）： 10-15.