真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的影響

劉生財 段俊朋 徐小萍 潘君飛 程春振 林玉玲 賴鐘雄

摘 要 為探討真菌誘導子與龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的相關性，以龍眼胚性愈傷組織細胞為材料，研究真菌誘導子種類、濃度及處理天數對龍眼愈傷組織細胞中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的影響。結果表明：在固體培養基中加入100 mg/L擬莖點霉菌誘導子培養35 d時，最有利于類黃酮含量的積累，含量高達8.58 mg/g；擬莖點霉菌誘導子濃度為50 mg/L時培養35 d，最有利于類胡蘿卜素含量的積累，其含量為36.83 μg/g；膠孢鐮刀菌誘導子濃度為50 mg/L時的培養基中培養35 d，最有利于單寧含量的積累，其含量為10.50 mg/g。液體懸浮培養條件下，膠孢鐮刀菌誘導子濃度為400 mg/L的培養基中培養7 d，最有利于類黃酮含量的積累，其含量為6.29 mg/g；尖孢鐮刀菌誘導子濃度為200 mg/L的培養基中培養7 d，最有利于類胡蘿卜素含量的積累，其含量為49.21 μg/g；膠孢鐮刀菌誘導子濃度為400 mg/L的培養基中培養7 d，最有利于單寧含量的積累，其含量為13.15 mg/g。本研究為將來龍眼胚性愈傷組織細胞工廠化生產類黃酮、類胡蘿卜素和單寧等次生代謝物質奠定理論基礎并提供技術指導。

關鍵詞 龍眼；胚性愈傷組織；真菌誘導子；類黃酮；類胡蘿卜素；單寧

中圖分類號 S667.2 文獻標識碼 A

Abstract To study the correlation between fungi elicitors and flavonoids， carotenoids and tannins in the embryogenic calli of longan， the embryogenic calli were used as the materials to investigate the effects of different kinds of fungi elicitors for the contents of flavonoids， carotenoids and tannin in callus cells. The results showed that under the condition of solid culture， the flavonoid content was the highest （8.58 mg/g） under the treatment of 100 mg/L Phomopsis longanae Chi for 35 d， and the carotenoid content was the highest （36.83 μg/g） under 50 mg/L P. longanae Chi treatment. For tannin， however， the content was the highest （10.50 mg/g） under Fusarium subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 35d. Under liquid culture， the flavonoid content was the highest （6.29 mg/g） under the treatment of 400 mg/L F. subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 7 d， the carotenoid content was the highest （49.21 μg/g） under the treatment of 200 mg/L F. Oxysporum for 7 d， and the tannin content was the highest （13.15 mg/g） under 400 mg/L F. subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 7 d. The above results could provide a scientific basis and technical support for studying the metabolic mechanism of flavonoids， carotenoids and alkaloids.

Keywords Dimocarpus longan Lour； embryogenic calli； fungal elicitors； flavonoids； carotenoids； tannins

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.015

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）屬于無患子科龍眼屬，是我國著名的熱帶亞熱帶特色水果之一，富含多種次生代謝產物，素有“南方人參”美譽，是國家衛生部公布的法定的藥用和食用兩用的植物。龍眼中含有類黃酮、類胡蘿卜素、單寧等多種次生物質[1-2]，具有很高的營養價值和藥用功能[3-4]。類黃酮是一大類重要的次生代謝產物，具有多種生物功能，包括藥用價值和保健功能，類黃酮生物合成研究已經成為植物次生代謝基因工程、代謝工程的主要目標[5]；類胡蘿卜素是目前國際上開發和應用最廣泛的天然色素之一，可作為食品、化妝品的著色劑被廣泛應用，而且具有豐富的營養價值[6]，預防和減緩癌癥的發展[7]；單寧也是具有抗氧化、抗癌等藥用價值和保健功能[8]，具有廣闊的市場前景。

根據植物細胞全能性理論，利用愈傷組織細胞可生產植物次生代謝產物。通過組培的方式能夠大大縮短生產周期，人為調控環境，不受季節等因素影響，實現周年生產，而且不會破壞生態資源。植物體中次生代謝產物的積累受到多種因素影響，誘導或者提高植物體內次生代謝產物產量具有重要的應用前景。研究人員通過物理手段（如pH、溫度等）和化學因素（如激素、誘導子等）提高生物體內代謝產物產量。尤其近幾年發現真菌誘導子能引起植物細胞生長及影響細胞產生代謝物質含量的積累[9]。真菌誘導子能使植物產生過敏反應，并通過誘導植物積累特定的次生代謝產物來提高防御抗病能力[10]。在青錢柳（Cyclocarya paliurus）[11]、雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）[12]、南方紅豆杉（Taxus chinesis var. mairei）[13]、北柴胡（Bupleurum chinense DC.）[14]等懸浮細胞培養中添加真菌誘導子可大幅度提高細胞中的有效成分含量。在龍眼果肉中可分離獲得龍眼擬莖點霉、鐮刀菌和炭疽菌。添加一定的龍眼擬莖點霉、尖孢鐮刀菌和膠孢鐮刀菌，可影響龍眼胚性愈傷組織中影響多糖[15]和類黃酮含量[16]，但賀夢真等[16]只是進行了低濃度真菌誘導子誘導龍眼胚性愈傷組織細胞中類黃酮含量影響，較高濃度的真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織細胞中類黃酮含量影響效果還明確。因此，為探討真菌誘導子與龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的相關性，本研究以龍眼胚性愈傷組織為材料，研究真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織細胞中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的影響，為將來龍眼胚性愈傷組織細胞工廠化生產類黃酮、類胡蘿卜素和單寧等次生代謝物質奠定理論基礎并提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為長期保存的龍眼胚性愈傷組織，來自福建農林大學園藝植物生物工程研究所[17]。

1.2 方法

1.2.1 真菌誘導子的制備 參照Wang等[18]的方法，制備膠孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬莖點霉菌（菌種由福建農林大學植物保護學院贈送）真菌誘導子。采用苯酚硫酸法[19]測定菌液中總糖含量的濃度（mg/L），根據真菌誘導子中的含糖量確定真菌誘導子的添加量。

1.2.2 真菌誘導子種類和濃度的篩選 將0.04 g龍眼胚性愈傷組織接種于固體培養基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+7 g/L瓊脂為基本培養基，pH為5.8，分別加入（膠孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬莖點霉菌）3種真菌誘導子，每種真菌誘導子分別設置濃度分別為50、100、200、300、400、500 mg/L，以不添加任何真菌誘導子為對照（Mock），然后放置于（25±2） ℃培養室進行20 d暗培養。收取龍眼胚性愈傷組織，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每種處理3次重復。

將2.0 g龍眼胚性愈傷組織接種于液體培養基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇為基本培養基，pH 5.8，分別加入（膠孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬莖點霉菌）3種真菌誘導子，每種真菌誘導子濃度分別設置為50、100、200、300、400、500 mg/L，以不添加任何真菌誘導子為對照（Mock），然后放置于（25±2） ℃，轉速為110 r/min的搖床上，黑暗培養7 d時收取龍眼懸浮細胞，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每種處理3次重復。

1.2.3 真菌誘導子處理時間的篩選 將0.04 g龍眼胚性愈傷組織接種于固體培養基中，以MS+ 1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+7 g/L為基本培養基，pH為5.8，添加本研究篩選得到最佳真菌誘導子種類和濃度，以不添加任何真菌誘導子為對照（Mock），放置于（25±2） ℃培養室進行10、15、20、25、30、35 d暗培養，然后收取龍眼胚性愈傷組織，將樣品置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每種處理3次重復。

將2.0 g龍眼胚性愈傷組織接種于液體培養基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+ 100 mg/L肌醇+7 g/L為基本培養基，pH為5.8，添加篩選得到最佳真菌誘導子種類和濃度，以不添加任何真菌誘導子為對照（Mock），放置于（25±2） ℃，轉速為110 r/min的搖床上，黑暗培養1、3、5、7、9、11 d時收取龍眼懸浮細胞，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每種處理3次重復。

1.2.4 龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素及單寧含量測定 參考董慧雪等[20]的方法提取和測定龍眼胚性愈傷組織中類黃酮；參考張志軍等[21]的方法提取及測定樣品的類胡蘿卜素；參考鞠春艷等[22]的方法提取及測定樣品的單寧。

1.3 數據處理與分析

使用SPSS 19.0數據處理軟件進行相關分析、方差分析和顯著性測驗，利用Excel 2010對所獲得的數據進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 真菌誘導子種類和濃度對龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的影響

真菌誘導子種類和濃度對龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量有明顯影響。由表1可見，固體培養基中添加擬莖點霉菌可有效地提高龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量，而且隨著濃度升高呈先上升后下降趨勢。當添加擬莖點霉菌濃度為100 mg/L時，龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量達到了5.39 mg/g，是對照組的4.11倍，且差異極顯著（p<0.01）。而添加尖孢鐮刀菌和膠孢鐮刀菌時，對龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量增加效果遠不如添加擬莖點霉菌。因此，添加100 mg/L擬莖點霉菌對龍眼胚性愈傷組織中類黃酮累積效果最好。

由表1可知，在液體懸浮培養過程中，添加真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量影響與固體培養條件下差異非常大。添加擬莖點霉菌對龍眼胚性愈傷組織中類黃酮累積有抑制作用，而且抑制效果達到極顯著水平；而添加一定濃度膠孢鐮刀菌可以促進類黃酮累積。隨著膠孢鐮刀菌濃度增加，類黃酮含量呈“下降—上升—下降”趨勢，且在濃度為400 mg/L時，龍眼懸浮細胞中類黃酮含量最高，是對照組的1.28倍，達到了極顯著水平。

2.2 擬莖點霉菌處理時間對固體培養龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的影響

根據真菌誘導子種類和濃度篩選結果，在固體培養基中加入100 mg/L擬莖點霉菌，分析不同處理時間對龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量的影響。由表2可見，隨著處理時間延長，龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量呈上升趨勢。在培養35 d時，培養基中添加擬莖點霉菌和對照培養基的龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量都達到最高，與其他處理時間相比達到極顯著水平，但擬莖點霉菌處理下類黃酮含量是8.58 mg/g，為對照的1.56倍。由此可知，添加100 mg/L擬莖點霉菌培養35 d有利于類黃酮含量的積累。

2.3 膠孢鐮刀菌處理時間對龍眼懸浮細胞中類黃酮含量的影響

根據真菌誘導子種類和濃度篩選結果，在液體培養基中加入400 mg/L膠孢鐮刀菌，比較不同處理時間對龍眼懸浮細胞中類黃酮含量影響。由表3可見，龍眼懸浮細胞類黃酮含量隨著培養時間的延長而增加，在懸浮培養7 d時含量最高，為5.75 mg/g，極顯著高于其他處理時間，隨后類黃酮的含量逐漸減少。由此可得添加400 mg/L膠孢鐮刀菌懸浮培養7 d最有利于類黃酮含量的積累。

2.4 真菌誘導子種類和濃度對龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量的影響

真菌誘導子種類和濃度對龍眼胚性愈傷組織類胡蘿卜素含量有明顯影響。由表4可見，在固體培養基上添加真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織類胡蘿卜素含量積累幾乎都有抑制，而且隨著濃度增加抑制效果越明顯。只有添加50 mg/L擬莖點霉菌真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量有促進作用，含量高達21.50 μg/g，是對照組的1.41倍。

液體懸浮培養條件下，真菌誘導子對類胡蘿卜素含量累積也是有抑制作用，但效果沒有固體培養條件下明顯。表4也可以看出，添加尖孢鐮刀菌濃度為200 mg/L對龍眼懸浮細胞中類胡蘿卜素含量有促進作用，與其他組相比達到極顯著水平，是對照組的1.16倍。且與固體培養相比，液體培養對促進龍眼懸浮細胞中類胡蘿卜素含量累積的作用效果更明顯。

2.5 擬莖點霉菌處理天數對固體培養龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量的影響

在固體培養基中加入50 mg/L擬莖點霉菌，分析不同處理天數對龍眼胚性愈傷組織類胡蘿卜素含量的影響。由表5可見，處理天數越久，龍眼胚性愈傷組織類胡蘿卜素含量越高。在培養30 d前，對照中類胡蘿卜素含量高于添加50 mg/L擬莖點霉菌的。但是，對照在培養20 d后，龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量增加比較緩慢，而添加50 mg/L擬莖點霉菌卻能夠保持快速增加，一直到培養結束，說明擬莖點霉菌可能是在胚性愈傷組織培養的中后期對類胡蘿卜素含量累積有作用。

2.6 尖孢鐮刀菌處理天數對龍眼懸浮細胞中類胡蘿卜素含量的影響

在液體培養基中加入200 mg/L尖孢鐮刀菌，分析不同處理天數對龍眼懸浮細胞類胡蘿卜素含量的影響。由表6可見，龍眼懸浮細胞類胡蘿卜素含量隨著培養天數的增加而增加，在懸浮培養7 d后，類胡蘿卜素的含量逐漸減少。由此可得添加200 mg/L尖孢鐮刀菌懸浮培養7 d最有利于類胡蘿卜素含量的積累。

2.7 真菌誘導子種類和濃度對龍眼胚性愈傷組織中單寧含量的影響

真菌誘導子種類和濃度對固體培養龍眼胚性愈傷組織單寧含量有明顯影響。由表7可見，與對照相比，添加擬莖點霉菌和膠孢鐮刀菌均表現為隨著濃度的增加，龍眼胚性愈傷組織單寧含量先增高后降低的趨勢，而添加尖孢鐮刀菌隨著濃度的增加，龍眼胚性愈傷組織單寧含量逐漸降低。當添加膠孢鐮刀菌濃度為50 mg/L時，龍眼胚性愈傷組織中單寧含量最高，達到了6.42 mg/g，是對照組的1.46倍；濃度為500 mg/L時，龍眼胚性愈傷組織中單寧含量明顯低于其他處理和對照。而在液體培養基中添加膠孢鐮刀菌濃度為400 mg/L對龍眼懸浮細胞中單寧含量有促進作用，是對照組的1.32倍。

2.8 膠孢鐮刀菌處理天數對龍眼胚性愈傷組織單寧含量的影響

膠孢鐮刀菌對龍眼胚性愈傷組織中單寧含量有促進作用。由表8可見，在固體培養基中加入50 mg/L膠孢鐮刀菌后，隨著培養時間的延長，龍眼胚性愈傷組織中單寧含量越高，而且高于對照，在培養35 d時單寧含量累積最多。

從表9可知，在液體培養基中加入400 mg/L膠孢鐮刀菌，龍眼懸浮細胞中單寧含量隨著培養天數增加，先增高后降低，第7天的含量達到最高，為13.15 mg/g；而對照在第9天時含量才達到最高，為11.32 mg/g，說明添加400 mg/L膠孢鐮刀菌懸浮培養可以促進單寧在較短時間內就可以積累。同時與固體培養條件相比，液體懸浮培養更有利于單寧累積。

3 討論

3.1 適宜的真菌誘導子類型和濃度有利于龍眼胚性愈傷組織中次生代謝產物積累

真菌誘導子（fungal elicitor）主要是通過分離真菌菌絲體或發酵液制備而成的含有真菌及代謝物的滅菌溶液，能引起植物細胞生長及影響細胞產生代謝物質含量的積累[9]。不同的真菌誘導子及濃度對不同植物材料的作用效果也存在很大差別。200 mg/L黑曲霉誘導子處理青錢柳懸浮細胞3 d三萜含量為對照的10.79倍[11]；50 mg/L蘋果炭疽和柿子炭疽誘導子的加入不僅使不定根中雷公藤甲素的含量分別提高了2.24、1.93倍，生物堿的含量也分別提高了2.02、2.07倍[12]；60 mg/L尖孢鐮刀菌促進南方紅豆杉紫杉醇的合成，與對照相比提高了5倍左右[13]；1 ml/L黑曲霉誘導子處理北柴胡毛狀根后的柴胡皂苷為對照的1.31倍[14]；80 mg/L炭角菌處理毛葡萄后黃酮和總酚分別為對照的1.76、1.65倍[23]。雖然在青錢柳、雷公藤、南方紅豆杉、柴胡、毛葡萄等懸浮細胞培養中添加真菌誘導子可大幅度提高細胞中的有效成分含量，懷地黃組培苗中添加真菌誘導子可提高其次生代謝產物含量[24]，但不同植物使用的誘導子及濃度也不一致，可能是因為不同的真菌誘導子參與了不同類型次生代謝產物代謝通路。對長春花研究發現，致病性真菌可以強烈促進長春花合成生物堿，而非致病性真菌效果不明顯[25]。本文研究了膠孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬莖點霉菌不同濃度添加量對龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素及單寧含量積累的影響，發現400 mg/L的膠胞鐮刀菌處理龍眼胚性愈傷組織后類黃酮和單寧的含量分別為對照的1.28、1.32倍，50 mg/L的擬莖點霉菌處理后類胡蘿卜素的含量為對照的1.41倍。該研究結果與賀夢真[16]研究發現100 mg/L的擬莖點霉菌處理龍眼胚性愈傷組織后類黃酮含量最高不一致，可能是因為處理濃度范圍和時間差異，本研究處理的濃度范圍更大，更有利于篩選出最佳處理濃度范圍。 因此，只有選擇適宜的真菌誘導子類型和濃度才有利于龍眼胚性愈傷組織細胞中次生代謝產物含量累積。

3.2 真菌誘導子處理時間對龍眼胚性愈傷組織中次生代謝產物積累的影響較大

除了真菌誘導子的種類和濃度之外，誘導處理的時間和培養方式也會對次生代謝產物產生很大的影響。真菌誘導子處理白樺懸浮細胞1 d三萜含量就能達到最高[26]，黑曲霉誘導子處理青錢柳懸浮細胞3 d三萜含量和產量均達到最高[11]，在積雪草添加哈茨木霉菌的第10天積雪草苷含量比對照組增加了2.35倍[27]。不同日齡的長春花懸浮細胞對誘導子的敏感性和反應不同，培養20 d的長春花懸浮細胞在綠色木霉誘導子作用下能顯著刺激阿瑪堿的產生[28]。本研究也發現，不同真菌誘導子的處理時間對固體和液體培養的龍眼胚性愈傷次生代謝積累的差別較大，且液體懸浮培養比固體培養更能在短時間內獲得大量的次生代謝產物，而且產量也高于固體培養。可能是因為在固體培養條件下，龍眼胚性愈傷組織細胞沒有完全接觸到培養基，誘導子對其作用存在緩釋和間接作用，從而促使龍眼中次生代謝產物的累積需要更長時間；而在懸浮培養中，因為細胞完全接觸培養基，誘導子可以快速直接作用于細胞，從而影響了次生代謝產物累積，并且不同的培養方式所需要的真菌誘導子類型或者濃度也有所差別。真菌誘導子是如何參與植物次生代謝通路還需要進一步研究。

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