酶聯免疫法測定大豆中赭曲霉毒素A

馮莉

摘要：赭曲霉毒素A易溶于水和小蘇打溶液，并且于極性有機溶劑中化學性質穩定不易發生反應。值得注意的是，赭曲霉毒素A具有較強的耐熱性，烘烤只能使其毒性減少1/5，而水煮或者水蒸也不能破壞其毒性。有研究者對赭曲霉毒素A的耐熱性做了研究，以半數存活量及50%有效性發現赭曲霉毒素A對熱因素比較穩定，100～200℃間沒有發現完全分解。檢測赭曲霉毒素A常用的方法有很多，現介紹的酶聯免疫法（ ELISA）則具有檢測速度快、靈敏度高、準確性強、可以方便準確的定量、操作相對簡便等優點，得到了快速發展和廣泛的應用。

關鍵詞：酶聯免疫法；赭曲霉毒素A；大豆；真菌毒素

中圖分類號：S565.1

文獻標識碼：B

文章編號：2095-9737（2018）08-0026-01

赭曲霉毒素是糧食真菌毒素污染的主要品種之一，赭曲霉毒素由赭曲霉和青霉菌污染大豆、玉米等飼料原材料及其他農副產品后所產生的一種具有強烈毒性的有害代謝物質。赭曲霉毒素產生速度快，存在范圍廣，許多菌種都可以產生赭曲霉毒素A，常用的實驗室檢測赭曲霉毒素A的方法很多，包括薄層色譜層析法（ TLC）、高效液相色譜法（HPLC），現主要介紹的是酶聯免疫吸附法（ELISA）。

1 儀器試劑

試劑：氯化鈉；氯化鉀；磷酸二氫鉀；十二水磷酸氫二鈉；吐溫20；檸檬酸鈉；檸檬酸；四甲基聯苯胺；過氧化氫（30%）；濃硫酸（98%）；赭曲霉毒素A標準物質；抗抗體；包被有抗抗體的48孔微孔板；赭曲霉毒素A單克隆抗體；赭曲霉毒素A酶標抗原；儀器：美國biorad680型酶標儀；實驗粉碎機；微量移液器；多空能旋轉混合器；渦旋混合器；電子天平（0.01 g）；20目標準篩。

以上藥品未特殊注明的均為分析純，水為一級水。

2 實驗原理

酶聯免疫分析法（ ELISA）結合了抗原抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化顯色反應。用提取液即甲醇與水的混合溶液（70%甲醇+30%蒸餾水）將粉碎后的大豆樣品中赭曲霉毒素A提取出來，經過一系列過濾稀釋后用酶標儀外標法測定赭曲霉毒素A的含量。

3 溶液配制

提取液：甲醇與水的混合溶液（70%甲醇+30%蒸餾水）；稀釋液：甲醇與水的混合溶液（5%甲醇+95%蒸餾水）；洗滌液：氫氧化鈉40.0 g+氯化鉀1.0 g+磷酸二氫鉀1.o g+十二水磷酸氫二鈉14.5 g；吐溫2.5 mL加蒸餾水徹底溶解并定容至500 mL，使用時稀釋10倍；赭曲霉毒素A稀釋緩沖液：氯化鈉8.0 g+氯化鉀0.2 g+磷酸二氫鉀0.2 g+十二水磷酸氫二鈉2.9 g用蒸餾水溶解并定容至1000 mL備用；檸檬酸緩沖溶液：檸檬酸鈉10.15 g+檸檬酸13. 76 g用蒸餾水溶解并定容至1000 mL備用；底物溶液甲：稱取0.4g四甲基聯苯胺用檸檬酸緩沖溶液溶解并定容至1000 mL備用；底物溶液乙：用移液器準確移取1.5 mL過氧化氫（30%）用檸檬酸緩沖溶液定容至1000 mL備用；反應終止液：移取濃硫酸（98%）22.2 mL緩慢加入到177.8 mL蒸餾水中。

4 樣品處理

將大豆樣品用四分法分取500 g，全部粉碎并使其全部透過20目篩，混合后用電子天平準確稱取5.OO g待測樣品于50 mL離心管中，隨后加入25 mL提取液，擰緊蓋子后置于多功能旋轉混合器中充分混合10 min，用高速定性濾紙過濾后，用微量移液器準確移取濾液200 μL于1.5 mL離心管中，再加入200 μL配置好的赭曲霉毒素A稀釋緩沖液，在渦旋混合器上渦旋混勻30 s，作為待測溶液備用。

5 標準曲線繪制及樣品檢測

5.1 樣品檢測

將微孔條插入酶標板的相應位置，分別加入50 μL待測溶液于微孔中，記錄加樣位置。再各加入50 μL赭曲霉毒素A酶標抗原，隨后再加入50 μL赭曲霉毒素A抗體溶液，在酶標板上加好板蓋，使反應在常溫下進行40 min；之后將板孔中液體全部棄去后，用洗滌液洗板4次，保證洗滌徹底后用吸水紙吸干殘余液體。之后再在孔中分別加入150 μL顯色底物溶液，反應15 min后加入終止液50 μL終止顯色反應，最后置于酶標儀中以630 nm為參比，測定450 nm處吸光度。

5.2 標準曲線繪制

用赭曲霉毒素A標準品和甲醇配制濃度為100 μg/mL的標準儲備液，再用稀釋液（5%甲醇溶液）配制濃度為O ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.O ng/mL、2.O ng/mL、5.0 ng/mL的赭曲霉毒素A標準序列溶液，經過與樣品提取溶液相同的處理后，用酶標儀測定其450 nm處的吸光度，以赭曲霉毒素A濃度的對數為橫坐標，吸光度的百分值為縱坐標繪制外標標準工作曲線。用樣品溶液測得的吸光度值與標準曲線比較定量。

6 結論

該方法相對于高效液相色譜法有特異性強、操作簡便等優點，較薄層色譜法具有定量準確等優勢，在檢測量大，對定量的靈敏度以及準確度有較高要求的實驗中，有較強的實用性。