蘑菇種植中污染菌產黃青霉的拮抗菌篩選及中藥和多菌靈對其抑制作用的研究

王藝璇 吳文杰 戴斯婷

摘 要：本實驗為減少蘑菇種植中產黃青霉的污染，進行了從土壤中分離純化出了產黃青霉的拮抗菌，及中藥黃柏、苦參及多菌靈和中藥正交對污染菌的抑制作用等實驗。從而需找一種生物防治或中藥和農藥結合防治的環保方法，以此來解決農藥對環境造成的污染及食用菌上的農藥殘留問題。實驗結果表明，中藥與多菌靈結合使用，比中藥單獨使用對產黃青霉的抑制效果更明顯。其中，黃柏與多菌靈的最佳組合濃度是黃柏濃度為0.25g/mL，多菌靈濃度為0.1%。苦參與多菌靈的最佳組合濃度是苦參濃度為0.016g/mL，多菌靈濃度為0.1%。土壤中通過直接堆砌法分離出的接抗菌經鏡檢，可以初步確定是屬于根霉屬。

關鍵詞：蘑菇；產黃青霉；中藥；拮抗菌；抑制

蘑菇，是人們較為熟知一種食用菌。各地的叫法都不同，統稱為蘑菇。蘑菇富含18種氨基酸和多種維生素，礦物質、蛋白質、無機質等營養成分。具有益氣開胃，拖痘疹，抗癌及降血糖等作用。蘑菇是冬季種植的食用菌[1]，蘑菇還是有一定的經濟價值及營養食用價值。但在種植食用菌的時候，其最大的敵人是雜菌污染，輕則減產，重則絕收，會給菇農造成不小的經濟損失。其中，產黃青霉的污染是在眾多污染中比較嚴重的雜菌污染。一般菇農采取的措施都是噴灑農藥，雖能使污染得到有效的處理，但往往都會造成農藥殘留，直接影響到質量。隨著人們環保意識的增加，還有對農藥負面影響的了解，既能達到高效殺死作物污染菌又能維護生態平衡以得到安全優質的農產品稱為人們關注的焦點[3][4]。尋求中藥或中藥與農藥相結合，通過減少農藥含量來減少對環境的污染是本研究的目的。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

廣東省微生物菌種保藏中心購買的產黃青霉真空冷凍干燥菌種；白蘑菇；泉州市區中藥店購買的黃柏、苦參；有效成分為50%的可濕性粉劑多菌靈；PDA培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、高氏一號培養基，實驗室自備；堿性品紅、美藍晶體，氫氧化鉀等，購于泉州化學藥品店。

1.2 儀器

培養基制備需要的各種玻璃器材[5]，移液槍，水浴鍋（數顯恒溫水浴鍋 HH-6國華企業），恒溫箱（生化培養箱SPX-25OB-Z，上海博訊實業有限公司醫療設備廠），高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-30 SII立式壓力蒸汽滅菌器），恒溫振蕩器（國華企業SHA-B），無菌臺（SW-CJ-IF潔凈工作臺）等。

2 實驗方法與結果

2.1 產黃青霉真空冷凍干燥菌種的菌種活化

菌株恢復培養：用無菌的移液槍吸取適宜無菌水滴入安瓿瓶管內，輕輕震蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。后吸取該菌液滴加在已無菌PDA平板上，涂布，在28℃的恒溫箱中培養，獲得純種產黃青霉[6]。

2.2 拮抗菌的篩選及鑒別

土壤分離微生物：選取土樣，然后參考《現代食品微生物學實驗技術》中的土壤微生物分離、純化的實驗方法，獲得各種微生物[5]。

拮抗實驗：采用直接堆砌法觀察抑菌圈的大小進行篩選：獲得純種產黃青霉后挑取單個菌落于液體培養基進行恒溫振蕩培養，24h后分別稀釋成10倍、100倍、1000倍制成不同稀釋倍數的菌懸液，再用移液槍分別吸取產黃青霉的菌懸液100μL均勻涂布在PDA平板上，依次挑取從土壤中分離、純化的單個菌落放入已經涂布了產黃青霉的PDA平板中，在適宜的溫度下培養。觀察有無拮抗現象，有無抑菌圈，來篩選出拮抗菌[7]。因實驗器材有限，且分離、純化的微生物種類又多，所以最初篩選時，每種從土壤中分離出的菌落做一個平板，有疑似拮抗效果的在做3個重復。

鑒別：通過形態的觀察[7]以及鏡檢，確定拮抗菌所在的屬，進行初步確定。

2.3 中藥濃度的確定及制備

中藥的熬煮：稱取100g中藥（黃柏/苦參），加適量蒸餾水浸泡30min，用大火煮沸，在小火保持微沸30min，過濾，濾液備用。藥渣再加適量蒸餾水煎煮30min，濾過，將兩次的濾液合并，用水浴鍋濃縮至100mL，此時的中藥生藥量為1g/mL[8]。

濃度的稀釋：取10支無菌試管，依次編號，分別在2～10號管中加無菌蒸餾水10mL。取1g/mL的中藥原液20mL于1號管中，從1號管中取10mL于2號管中，混勻，再從2號管中取出10mL稀釋液加到3號管中混勻。照此方法稀釋至第9號管，取出10mL棄掉。第10號管只有無菌蒸餾水做空白對照[8]。

2.4 中藥對蘑菇菌絲生長的影響

蘑菇菌懸液的制備：將購買于市場上的白蘑菇，用酒精將表面清洗干凈后，用滅菌的鑷子將蘑菇的子實體剪碎成細小塊，泡在無菌蒸餾水中，得到蘑菇的菌懸液[9]。

中藥對蘑菇菌絲生長的影響：將蘑菇的菌懸液100μL涂布在PDA培養基上，后用采用打孔法，在培養基上打孔，分別在孔內注入各種濃度的中藥藥液100μL，并標記。接種完成后，將平板放在28℃的恒溫箱中培養。每個濃度做3個平板，每個平板上有兩個重復。

2.5 多菌靈與中藥正交實驗

多菌靈濃度的設置：根據周傳富等人的研究發現，多菌靈的濃度不宜超過0.3%，否則會抑制食用菌菌絲的生長[10]。同時徐方旭、楊文欽等人的研究則表明食用菌中應首選多菌靈、克霉靈和生石灰等，其主要使用體積分數為0.07%～0.10%，對個別食用菌可選擇性地使用體積分數為0.20%的藥物，在生產上不能盲目使用[11][12][13][14]。根據中藥對產黃青霉的抑制作用來篩選出有抑制作用的濃度，在根據文獻來具體設置需要的多菌靈的濃度。一般在0.1%～0.2%之間。

正交試驗的設置：根據篩選出的中藥濃度，并以此設置的多菌靈濃度，參考統計書[15]上的正交表，設置正交試驗。

2.6 結果與分析

（1）拮抗菌的確定。

接抗菌的篩選結果：從土壤中分離純化的各種微生物分別接種在涂布了1*10-2濃度的產黃青霉的PDA平板上，其中編號為b的平板上有明顯的抑菌圈，其余平板均無抑菌圈。

形態觀察：接種在PDA培養皿上，放在28℃的恒溫箱中培養24h后就發現培養基表面已經全部覆蓋了白色的菌絲，且無定形菌落。繼續培養一段時間以后，白色菌絲慢慢變成淡灰色的菌絲。

鏡檢：采用堿氏品紅染液和呂氏堿性美蘭兩種分別對拮抗菌進行簡單染色[5]，后在顯微鏡下由低—高倍鏡觀察。發現拮抗菌的菌絲無隔膜，有分枝、假根、孢子囊。

（2）拮抗菌對蘑菇菌絲生長的影響。

拮抗菌對蘑菇菌絲生長的影響：在涂布了蘑菇菌懸液的PDA平板上，接種b號平板上挑取的單個菌落，放于28℃的恒溫箱中培養24h后，可觀察到沒有抑菌圈如圖4。說明從土壤中分離出的產黃青霉的拮抗菌對蘑菇菌絲的生長并無抑制作用。

（3）中藥對產黃青霉生長的影響。

黃柏對產黃青霉生長的影響：接種24h后可以觀察到所有平板都布滿了產黃青霉的白色菌絲，其中只有2、3號平板有明顯的抑菌圈，對應的即是黃柏的濃度分別為0.5g/mL、0.25g/mL。

苦參對產黃青霉生長的影響：在涂布了10-2濃度的產黃青霉的平板上，經過24h可以觀察到同樣布滿了白色菌絲，其中只有6、7、8三個平板有明顯的抑菌圈，即對應苦參的濃度為0.016g/mL、0.008g/mL、0.004g/mL。

（4）中藥對蘑菇菌絲生長的影響。

黃柏對蘑菇菌絲生長的影響：接種24h后，可以明顯看到PDA平板上布滿菌絲，在注滿黃柏藥液的孔洞周圍有明顯的抑菌圈，但黃柏濃度不同，抑菌圈的大小也不同。黃柏濃度為0.25g/mL時，蘑菇菌絲的抑菌圈直徑為1.12cm左右，而濃度為0.5g/mL時，蘑菇菌絲的抑菌圈直徑為1.32cm左右。

苦參對蘑菇菌絲生長的影響：同樣接種24h后可以明顯看到PDA平板上布滿菌絲，孔洞的周圍同樣有明顯的抑菌圈。接種六號管苦參的平板上抑菌圈的直徑大小大概為1.23cm，接七號管苦參的抑菌圈直徑在1.48cm左右，而接八號管苦參的抑菌圈直徑大概在1.30cm。

（5）多菌靈與中藥正交對產黃青霉生長的影響。

結果表明：在黃柏與多菌靈正交中，P=0.001<0.01，所以黃柏與多菌靈共同作用中最佳組合濃度對產黃青霉的抑制具有極顯著影響，即黃柏濃度為0.25g/mL，多菌靈濃度為0.1%。

結果表明：在苦參與多菌靈正交中，P=0.993>0.05，所以苦參和多菌靈共同作用的最佳對產黃青霉的抑制沒有顯著影響。

3 結論

黃柏和苦參在一定濃度的時候對產黃青霉還是有一定的抑制作用，并且特定濃度的抑制效果還是很明顯的。黃柏的十個濃度梯度中，只有0.5g/mL、0.25g/mL兩個濃度對產黃青霉有抑制效果，其中0.5g/mL的效果最好，抑菌圈的直徑大小平均達到1cm，0.25g/mL的抑制效果略差些。而苦參的只有0.016g/mL、0.008g/mL、0.004g/mL三個濃度對產黃青霉有抑制效果，其中效果最好的是0.004g/mL，抑菌圈平均直徑達到2.0cm。黃柏與農藥多菌靈共同作用的效果會明顯些，其最佳濃度組合為黃柏濃度為0.25g/mL，多菌靈濃度為0.1%。拮抗菌對產黃青霉的抑制效果，從抑菌圈來看，平均直徑是1.6cm，而藥劑對產黃青霉作用產生的抑菌圈的平均直徑是1.85cm。從數據上來看，還是藥劑對污染菌的抑制效果強些。但效果并不會差太多，如果從環境保護方面來說，使用拮抗菌來減少污染菌產黃青霉更為理想。

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項目名稱：福建省中青年教師教育研究課題“泉州市食用菌栽培中有效抗霉抗菌的綠色防控技術研究”項目編號：JA12276