利用正向重復片段的GUS報告基因檢測DNA雙鏈斷裂引起的基因重組研究

鮑岳 張俊華 蘇振華 曹雪松

摘 要：本研究建立了一種方便快捷地檢測DNA雙鏈斷裂引起的基因重組的方法。傳統的檢測DNA雙鏈斷裂的方法較為復雜、繁瑣。因此，構建簡單、快速的此類檢測技術是非常必要的。本研究構建了利用正向重復片段的GUS基因載體以及引導RNA和噬菌體MS2外殼蛋白偶聯限制性核酸內切酶的基因組編輯系統，在GUS基因內部DNA重復區切割DNA，導致雙鏈斷裂（doublestrand breaks， DSBs），DSB經同源序列引導修復（homologydirected repair， HDR）途徑，引起GUS基因重組，恢復其功能。此方法可以經過GUS染色后快速、直觀地檢測位點特異的DSB。通過GUS與其底物的反應，以達到半定量、直觀快速檢測DSB的目的。

關鍵詞：GUS基因；DNA雙鏈斷裂；GUS染色；基因重組

中圖分類號：Q784 文獻標識碼：A

AnEfficient Detecting System for Genes Recombination Caused by DNA Double

Strand Breaks Using Direct Reapeated Report Gene of GUS

Bao Yue Zhang Junhua Su Zhenhua Cao Xuesong*

College of Life Sciences Liaocheng University Shandong Liaocheng 252000

Abstract： In this study， a convenient and quick method for detecting gene recombination caused by DNA double strand breaks （doublestrand breaks，DSBs） was established. DNA DSBs can cause sitespecific homologydirected repair（HDR）. However， the traditional methods of detecting DNA DSBs are complicated and cumbersome. Consequently， it is necessary to develope such a simple and fast detection technique. This study was conducted by using the direct repeated GUS gene and guide RNA combined with phage MS2 coat protein coupled with restriction endonuclease genome editing system， in which gRNA is complementary with GUS repeat sequences. Based on producing DSBs， functional GUS gene can be restored via HDR. By using the staining reaction of GUS with its substrate， the results can be achieved and quantitative detection of DSBs can be established. This method can be used quickly to detect site specific DSBs and intuitively observe the results after GUS staining.

Key words： GUS gene； DNA double strand breaks； GUS staining； gene recombination

1 緒論

隨著生命科學的研究和發展，數量繁多的基因或其調控因子的功能需要鑒定，作為研究基因功能最為有效的方法，定點基因突變研究越來越受到人們的關注，基因組編輯（genome editing， GE）技術應運而生。因此，建立一種高效而又精確的檢測基因定點突變技術是十分必要的。而檢測GE的前提是能夠檢測DSB，但是傳統的檢測DNA雙鏈斷裂的方法較為復雜、繁瑣。因此，構建簡單、快速的此類檢測技術是非常必要的。近年來，伴隨著不同的核酸酶以及DNA結合蛋白的結構和性質的闡明，基因組編輯技術已推廣及其應用到許多生物中。將DNA結合蛋白的識別結構域和核酸酶的切割結構域相結合，實現對任意的特定DNA序列進行定點識別與切割。造成的DNA產生DSBs，后者通過兩種DNA修復方式，一種是HDR，另一種是非同源末端連接（nonhomologous end joining， NHEJ）。HDR在有外源的同源DNA存在的情況下，能夠實現對特定堿基的替換，即對點突變進行恢復。NHEJ則是在被切割處的DNA序列發生缺失或插入等的突變。目前被廣泛應用的GE技術主要有人工介導的鋅指核酸酶技術（zinc finger nuclease， ZFN）、類轉錄激活因子效應物核酸酶技術（transcription activatorlike effector nucleases， TALEN）和由RNA介導的規律成簇間隔短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）技術，DSB經過細胞內源性修復機制（HDR或NHEJ）的修復從而實現基因的插入、缺失和堿基替換等基因突變，以達到引起不同細胞系或生物體中的基因組發生改變的目的。再者，GE是能夠破譯基因功能和可以應用到基因治療的一種有力工具。而在CRISPR /Cas系統中，Cas9核酸內切酶識別所必需的原間隔序列的3端含有的一個原間隔臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM），PAM區是CRISPR/Cas系統中Cas蛋白識別CRISPR的序列標記[1，2]，對雙鏈進行切割。此外，最近的研究表明，該系統與ZFN和TALEN一樣，可在非目標位點進行打靶，從而造成脫靶現象[3，4]。因此，對DNA雙鏈斷裂進行檢測是研究GE產生及其效率的關鍵。DNA雙鏈斷裂的檢測技術主要有以下幾類。

1.1 γH2AX檢測方法

DNA損傷及雙鏈斷裂的檢測方法有很多，目前最為常用的是γH2AX檢測方法。組蛋白2A變異體（histone family 2A variant， H2AX）屬于核心組蛋白H2A家族中的一個亞型。DNA損傷及雙鏈斷裂后，產生磷酸化底物。這些DSBs都具有快速誘導H2AX的大量磷酸化（γH2AX）和簇集的功能[5]。所以，γH2AX可以作為DNA的損傷標記[6]，通過檢測γH2AX，進而可以檢測DNA雙鏈斷裂，該方法在藥理學和臨床醫學領域均有應用。

迄今為止，已經開發了很多種技術和方法來檢測γH2AX， Rogakou等在正常的細胞受到外源性的物理輻射后觀察到H2AX發生磷酸化，并導致γH2AX斑點出現[7]；在γH2AX斑點形成后，觀察斑點的數目與DSB的數量呈正相關[8，9]。據此有研究表明，由γH2AX焦點的數量推算出的輻射劑量與DNA的DSB的數量曲線中可以計算出，每一個已經完成培養的正常的細胞可以在每單位輻射劑量（Gy）的電離輻射下造成有3539個DNA的DSB損傷的出現[10]。而檢測的方法主要包括（1）免疫熒光染色結合熒光顯微鏡分析方法：這個方法被應用于早期DNA損傷研究，主要利用熒光顯微鏡技術和顯微鏡成像技術[11]。如果是用人工進行分析，通過熒光顯微鏡檢查是否有熒光標記的γH2AX 灶點。缺點在于人工進行操作，人為的觀察可能會對實驗結果造成影響和偏差較大[12，13]。如果是自動化分析，基于手動操作或者是全自動顯微鏡，對熒光染色并制成玻片標本的細胞拍照后，利用圖像分析軟件分析每個細胞核中的γH2AX 灶點的數目和分布以及它們的熒光強弱。利用自動化進行分析，相比較于人工分析，優點在于準確性高、結果更加可靠，而且相較于人工操作，自動化分析的速度更快，能夠得出把所得的定量的結果直接進行圖片保存，方便以后的分析[14]；（2）流式細胞術（ flow cytometry，FCM） 分析方法：使用流式細胞儀分析經過免疫熒光標記的細胞，能夠分析每個細胞核中的熒光強度，甚至能夠測定含有熒光的細胞所占的百分比是多少[15]。這種方法的優點就在于速度快，準確性高。但缺點也是非常顯著的，由于被分析的細胞被破壞，無法分析每個細胞核中γH2AX 灶點個數和分布[16]；（3）全細胞酶聯免疫反應（ Wholecell ELISA assay） 檢測方法：這種檢測方法所依據的原理是利用使用過氧化物酶結合的第二抗體去替代免疫細胞化學方法中的熒光分子結合的第二抗體，然后過氧化物酶與底物進行反應，能夠產生一定量的顯色產物，從而得到細胞內γH2AX的含量。這種操作方法的優點就在于操作簡單、速度快。但缺點是不能準確分析每個細胞核內的γH2AX 灶點數量和分布數據[17]。

總之，利用γH2AX對DNA雙鏈的斷裂進行檢測，方法較為復雜，操作比較繁瑣。再者，有部分細胞活動并不導致DSBs的產生，但是仍然有可能產生γH2AX，因此有必要針對具體應用進行預實驗，優化實驗條件，并分析γH2AX產生的機制；第三，雖然檢測到的γH2AX 含量和DSBs呈正相關關系，但不能精確計算出后者產生的數量。

1.2 熒光報告基因檢測

還有一種方法是利用熒光報告基因來檢測DSB。這種方法是通過構建突變的熒光蛋白載體來實現的。該技術又分為二類，一是構建在熒光蛋白基因內部插入含有終止密碼DNA片段載體，當經過GE導致插入DNA片段產生突變后，一部分熒光蛋白基因的讀碼框恢復功能，因而可通過檢測熒光來檢測DSB[18]。但該方法只能檢測到使熒光蛋白基因恢復讀碼框的突變，而其余的則不能檢測到；第二類是構建含有重復DNA片段的熒光蛋白或其他報告基因的載體，當經過GE導致重復DNA片段產生突變后，經過HDR修復使熒光蛋白基因的讀碼框恢復功能，因而可通過檢測熒光來檢測DSB[19]。但目前該方法在植物突變研究中，主要在轉基因植物中進行，實驗耗時長。

1.3 GRATEN系統

我們構建了引導RNA偶聯核酸內切酶（guided RNA and tethered endonuclease， GRATEN）引起DSB的技術，基于序列重疊的β葡糖醛酸糖苷酶（GUS）基因[20]，通過HDR修復產生的基因突變進行恢復。GRATEN系統包含二個組分，一是串聯的引導RNA （guided RNA， gRNA）和可與噬菌體MS2外殼蛋白（MS2 coat protein， MCP）結合的RNA；另一部分是融合的MCP和核酸內切酶FokI切割結構域基因。該系統的工作原理是，當gRNA與基因組的同源DNA配對形成R環（Rloop）結構后，與MCP結合的RNA通過將FokI引導至Rloop鄰接區域，二聚體化的FokI切割DNA形成DSB，導致GE的產生（圖A）。為了驗證GRATEN系統產生DSB的可能性，我們在植物表達載體中構建了含有部分重復序列的GUS基因（35SGUUS）。通過在煙草（Nicotiana benthamiana）葉片中瞬時共表達GRATEN和35SGUUS，GUS基因得到恢復。證明GRATEN導致序列特異性DSB以及利用35SGUUS檢測DSB是切實可行的。

Figure A： GRATEN system[HT]

GRATEN系統載體的構建：在TNPs模塊中，淺藍色部分為花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子；核定位信號（NLS）（紫色部分）；核酸內切酶FokI（粉色部分）；噬菌體外殼蛋白MCP（黃色部分）；胭脂氨酸合成酶的轉錄終止子Tons（灰色部分）；在gRNA模塊中，5'端的發夾結構以藍色矩形表示、MCP binding以棕色矩形表示、gRNA以紅色矩形表示；擬南芥Pol III啟動子（AtU6）；5'端的發夾結構（Hp）；三個結合MS2的位點（3XMS2 binding）；對應基因組靶位點的gRNA（Target）；終止AtU6啟動的翻譯終止子，8個胸腺嘧啶（8T）。

Schematic of GRATEN system. In the TNPs， 35S promoter from cauliflower mosaic virus （CaMV） in white； nuclear localization signal （NLS） in purple； endonuclease FokI in pink； MS2 bacteriophage coat protein （MCP） in yellow； transcriptional terminator of nopaline synthase gene（Tnos） in gray； In the gRNA， the 5 end hairpin， gRNA and MCP binding sites are denoted in blue， red and brown lines respectively. AtU6， promoter of polymerase III from Arabidopsis thaliana； Hp， 5 end hairpin structure； 3×MS2 binding， triple MS2 binding sites； Target， target sequence in genomic locus. 8T， octuple thymines for terminating transcription driven by U6 promoter.

2 材料和方法

2.1 GRATEN系統的構建

我們所構建的GRATEN系統，是由以下原件組成：① Pol III啟動子。將編碼gRNA的DNA克隆到該啟動子下游，其中gRNA是針對目標DNA設計的；②FokIMS2FokI融合基因克隆。將FokIMS2FokI三個基因片段串聯，二端加上核定位信號（Nuclear Localization Signal， NLS），并在C端加6×His標簽。將以上串聯的基因克隆到植物表達載體35S啟動子下。上述克隆經DNA測序驗證。如圖A所示，MS2蛋白可以形成同源二聚體結構，這個同源二聚體結構首尾反向平行，在MCP的兩端連接FokI限制性核酸內切酶，形成一個結構形式為FokIMS2FokI的融合蛋白，命名為偶聯核酸融合蛋白（tethernuclease fusion proteins，TNPs），所形成的這個二聚體會在靶DNA的RLoop結構上游對DNA進行切割，造成DSBs。而在我們的實驗中，就是對GUUS的重復片段進行切割，切割完成后，通過HDR途徑恢復成有功能的GUS基因，然后，利用GUS基因的特性進行檢測。

我們的模板選擇載體質粒pBluescript II KSGUS1進行PCR的擴增，NGUS5和NGUR作為擴增引物，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠檢測到擴增產物為1035bp的GUS1片段（圖B）；我們的另外一個擴增是以NUSF和NGUS3為引物，以載體質粒pBSGUUS為模板，檢測到擴增產物為1413bp的GUS2片段（圖C）；若載體變為Nco I和Bste II雙酶切載體質粒pBSGUUS，則是2423bp的GUUS片段（圖D）；以載體質粒p1305GUUS為模板，以NGUS5和NGUS3為引物進行PCR擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，即得到2423bp的GUUS片段（圖E）。

2.2 植物材料及轉基因操作

實驗材料選擇生長狀況良好的本氏（Nicotiana Benthamiana， N. Benthamiana）煙草植株。

將構建的重組載體質粒與對照共同轉化農桿菌，將含表達載體的農桿菌轉接種于LB液體培養基培養直至對數生長期，離心收集菌體，然后加入滲透注射緩沖液，重懸至OD600 值約為 0.5～1.0，遮光條件下室溫靜置 2～3 hrs后用于滲透注射。滲透注射苗齡為4周左右的煙草葉片，采用農桿菌滲入法侵染煙草葉片，用針頭在植株葉片上扎兩個孔，用無針頭的注射器對葉片進行注射，依靠壓力將菌液注入葉片的葉脈之間，實現農桿菌介導的植物瞬時表達。滲透注射后的煙草植株在弱光條件下培養一天，然后放于可見光下正常培養，瞬時表達48h后取材進行實驗。

2.3 GUS染色及觀察

GUSRec系統的工作原理（詳見圖F），我們通過將構建的載體質粒與p1305GUUS載體質粒轉化農桿菌，共同滲透注射4周左右苗齡的煙草葉片，進行農桿菌植物瞬時表達，培養三天后剪下葉片進行GUS染色和觀察。

（1）GUUS表達載體。35S及NOST分別為啟動蛋白表達的啟動子和終止子，兩個灰色方框（U）表示GUS基因內部重復片段，gRNA的識別和切割序列用箭頭來表示；（2） GUSRec與我們所設計的載體共同表達，經gRNA引導并經TNP切割產生DSB，GUS基因內部重復片段間經同源鏈交換重組；（3）GUS基因恢復正常閱讀框。

（1）GUUS expression vector. 35S and NOST are promoter and terminator for gene transcription respectively， two gray boxes （U） represent the direct repeats of intenal GUS gene， gRNA recognition and cleavage sequence represented by arrows. （2）GUSRec and the vector are expressed in one cell simultaneously， after gRNA guiding and cleavaged by TNP ， producing DSB， GUS gene can be restored between direct repeat sequences by singlestrand invasion， strand exchange and homologous recombination.（ 3）GUS gene recover to normal reading frame.

3 結果

觀察瞬時表達GUS，得到了以下的結果：空載體瞬時表達后，經GUS染色后沒有顏色（如圖G1）；以gRNA作對照，經GUS染色后沒有顏色（如圖G2）；GUS表達體瞬時表達后，經GUS染色呈現出藍色（如圖G4）；只轉化p1305GUUS載體質粒的葉片，經GUS染色后不會出現藍色（如圖G3）；共同轉化p1305gRNAFMF載體與p1305GUUS載體，能夠瞬時表達GUS，經GUS染色后呈現出部分藍色（如圖G5），為了避免因葉片狀態對瞬時表達造成的影響，觀察同一葉片瞬時表達，如圖G6。說明GUUS基因經切割重組后恢復為正常讀碼框的GUS基因，并翻譯成GUS蛋白。并且這種發生在GUS基因內部重復區的位點特異性雙鏈斷裂是由gRNA引導的，而且是由二聚體FokI切割產生的。因此我們證明我們設計的GRATEN系統能夠在特定位點進行切割，并且由切割產生的DSB及其經HDR修復的效率較高（約為35%），該技術系統可用于快速檢測基因組編輯產生的特異位點DNA切割及其HDR修復。

4 結論

利用報告基因檢測位點特異性DSB不僅可用于驗證GE致突變的特異性和效率，而且可研究各種生物和非生物致突變劑對DNA的損傷程度，同時也可研究動植物在生理條件下產生DSB及其損傷修復機制。已有的檢測DNA的DSB技術存在以下缺點：（1）操作步驟繁瑣。如γH2AX檢測方法；（2）結果不穩定。如利用熒光報告基因進行的檢測，一是需要熒光顯微鏡。二是在進行檢測時，在紫外光下熒光會迅速產生淬滅，對精確統計結果有影響；三是植物細胞會產生自發熒光，對結果存在干擾；（3）植物中尚缺乏快速、穩定檢測方法。植物中利用GUUS系統只運用于轉基因植物的DSB及其DNA重組研究，尚未發現利用其檢測基因瞬時表達的研究。我們的實驗結果具有以下的優點：（1） 實驗步驟簡單，得到結果較快。整個實驗過程只需23天即可得到結果。相較于轉基因植物具有較高的效率，并且可作為后者的先期驗證性實驗；（2）GUS染色穩定，結果重復率高；（3） GUS染色是經 β葡萄糖醛酸酶（betaglucuronidase）催化底物5溴4氯3吲哚β葡萄糖苷酸（XGluc）而產生藍色反應物，由于酶促反應具有較高的效率，因此我們推測利用GUS基因恢復技術可檢測發生頻率較低的基因組DSB；（4）首次發現GRATEN系統可產生位點特異性的DSB，并且其切割DNA效率較高。該系統具有以下特點：（1）設計、構建打靶載體簡單。因為與MCP結合RNA以及MCP：FokI融合蛋白只需構建一次，只需將針對特定基因組序列的gRNA構建到載體中U6啟動子的下游。（2）系統作用效率高。由于gRNA與MCP：FokI融合蛋白在同一載體上，可實現在同一細胞中同時高效表達以上二個組分及其產生作用的目的，避免了因RNA和蛋白分別在二個載體表達，從而需要共同侵染植物而產生的共表達效率低的弊端。

作者貢獻：

曹雪松老師負責實驗的設計，鮑岳主要負責實驗的完成和數據的分析以及論文的撰寫，張俊華和蘇振華負責實驗的協助進行，全體作者閱讀并同意全文。

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基金項目： 項目來源“基于CRISPR/Cas系統的新型植物基因組編輯技術研究”（No：31370387）

作者簡介：第一作者鮑岳（1993），女，山東聊城人，碩士，研究方向：基因組編輯。

*通訊作者：曹雪松（1962），男，安徽人，博士研究生，教授，研究方向：基因組編輯。