高效液相色譜法測定羥基喜樹堿在不同有機溶劑和增溶劑中的平衡溶解度*

劉曉芳，王 嬰，李木生，聶 晶，張 昕，王 巖（廣東藥科大學(xué)，廣東廣州510006）

羥基喜樹堿（HCPT）來源于中國特有植物喜樹，是一種拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑[1?2]，可特異性作用于拓撲異構(gòu)酶Ⅰ，通過抑制DNA復(fù)制而發(fā)揮抗癌作用。作為喜樹堿結(jié)構(gòu)A環(huán)上的第10位氫原子被羥基取代而形成的衍生物——HCPT活性更高而毒性較低，抗癌作用是喜樹堿的30倍[3?4]。HCPT是中國學(xué)者獨立研發(fā)的喜樹堿衍生物，具有顯著的抗癌活性和較廣的抗癌譜，不易與其他常用抗癌藥物形成交叉耐藥性，可廣泛用于治療各種惡性腫瘤，如肝癌、胃癌、頭頸部腫瘤、白血病、膀胱癌等[5?7]，是目前我國臨床應(yīng)用較多的喜樹堿類藥物。

HCPT微溶于甲醇、氯仿等有機溶劑，不溶于水，見光不穩(wěn)定，與酸不能形成鹽，遇堿不穩(wěn)定，易開環(huán)形成鈉鹽。本研究建立了HCPT的高效液相色譜（HPLC）法，比較了其在不同有機溶劑和增溶劑中的平衡溶解度，為進一步研發(fā)其新劑型奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 ZD?85氣浴恒溫振蕩器（常州市偉嘉儀器制造有限公司）、LC?10A高效液相色譜儀（日本島津公司）、Diamonsil C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm，德國迪馬公司）、AY120托盤電子分析天平（日本島津公司）、TU?1901型雙光束紫外可見光光度計（北京普析通用儀器公司）等。

1.1.2 試劑與藥品 HCPT原料藥（南通飛宇生物科技有限公司，批號：FY20150901），HCPT對照品（南通飛宇生物科技有限公司，批號：FY16951008），甲醇、N，N?二甲基甲酰胺、聚乙二醇?400（PEG?400）、PEG?4000（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），氯仿（分析純，天津致遠化學(xué)試劑有限公司），二甲基亞砜、乙酸乙酯、吐溫?80（分析純，天津市百世化工有限公司），甘油（分析純，天津市富宇精細化工有限公司），聚氧乙烯氫化蓖麻油（分析純，德國BASF公司），十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純，天津福晨試劑有限公司），甲醇（色譜純，瑞典Oceanpak公司）等。

1.2 方法

1.2.1 建立HCPT含量測定方法[8?9]

1.2.1.1 選擇檢測波長 取適量HCPT溶解于甲醇中，經(jīng)適當(dāng)稀釋后以甲醇作為空白對照溶液，于200～400 nm波長下進行掃描以確定檢測波長，并繪制紫外吸收光譜圖。

1.2.1.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Dia?monsil C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇∶磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH=5.0）=60∶40；檢測波長為384 nm；柱溫為30℃；流速為0.6 mL/min；進樣量為20μL。理論塔板數(shù)按HCPT峰計算應(yīng)不小于2 000。

1.2.1.3 制備對照品溶液 精密稱取已干燥至恒重的HCPT對照品9.9 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度線，搖勻靜置，即得99μg/mL的HCPT對照品溶液。

1.2.1.4 制備供試品溶液 精密稱取已干燥至恒重的HCPT原料藥3.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度線，即得HCPT供試品溶液。

1.2.1.5 專屬性考察 精密吸取20μL甲醇空白對照溶液、HCPT對照品溶液、HCPT供試品溶液按1.2.1.2項下色譜條件進樣檢測，記錄HPLC色譜圖。

1.2.1.6 制備標準曲線 精密量取一系列劑量（分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mL）的 HCPT 對照品溶液于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為 0.99、1.98、3.96、7.92、15.84、31.68、63.36 μg/mL的標準溶液。按1.2.1.2項下色譜條件進樣檢測，以藥物質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。

1.2.1.7 精密度考察 精密量取適量HCPT對照品溶液于10 mL棕色容量瓶中，配制高（9.90μg/mL）、中（4.95μg/mL）、低（0.99μg/mL）3個質(zhì)量濃度的 HCPT對照品溶液。按1.2.1.2項下色譜條件進樣檢測，每天吸取高、中、低3個質(zhì)量濃度的HCPT對照品溶液進樣檢測，重復(fù)進樣5次，連續(xù)進樣5 d。記錄峰面積，計算藥物質(zhì)量濃度及相對標準偏差（RSD）值。

1.2.1.8 重復(fù)性考察 精密稱取同一批號HCPT原料藥3.0 mg，按1.2.1.4項下平行制備供試品溶液6份，按1.2.1.2項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，計算RSD值。

1.2.1.9 穩(wěn)定性考察 按1.2.1.4項下制備供試品溶液，于室溫下放置，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 后進樣檢測，記錄峰面積及RSD值。

1.2.2 HCPT在不同有機溶劑中的平衡溶解度測定[10?11]取HCPT原料藥10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，分別加入甲醇、氯仿、氯仿?無水乙醇（7∶3）、二甲基亞砜、乙酸乙酯、N，N?二甲基甲酰胺、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇9種有機溶劑，超聲溶解藥物，分別定容至刻度線，置于氣浴恒溫振蕩器，于（37.0±0.5）℃振蕩48 h以達到平衡狀態(tài)，吸取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜濾過后取續(xù)濾液，按1.2.1.2項下色譜條件檢測，記錄峰面積，計算平衡溶解度。

1.2.3 HCPT在不同增溶劑中的平衡溶解度測定 取HCPT原料藥10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，分別加入不同體積分數(shù)（0.1%、0.5%、1.0%）吐溫?80、PEG?400、PEG?4000、泊洛沙姆 F?68、甘油、RH?40、SDS 7 種增溶劑，超聲溶解藥物，分別定容至刻度線，置于氣浴恒溫振蕩器中，于（37.0±0.5）℃振蕩48 h以達到平衡狀態(tài)，吸取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜濾過后取續(xù)濾液，按1.2.1.2項下色譜條件進樣檢測，計算平衡溶解度。

2 結(jié) 果

2.1 HCPT含量測定方法的確定

2.1.1 檢測波長 HCPT在222、266、384 nm處均有吸收，因紫外線末端吸收有干擾，故選擇384 nm為檢測波長。見圖1。

圖1 HCPT紫外吸收光譜圖

2.1.2 專屬性 當(dāng)檢測波長為384 nm時，HCPT對照品溶液的出峰時間為8.3 min，分離度良好，且HCPT供試品溶液出峰時間與對照品溶液保持一致，空白對照溶液無干擾，表明專屬性良好。見圖2。

圖2 HCPT的HPLC色譜圖

2.1.3 線性標準曲線 線性回歸方程為Y=51 875X+395 188，R2=0.999，表明 HCPT 在 0.99～63.36μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度 高、中、低3個質(zhì)量濃度HCPT對照品溶液日內(nèi)、日間精密度RSD均小于3.000%，表明精密度良好。見表1。

表1 HCPT精密度考察結(jié)果

2.1.5 重復(fù)性 6份供試品溶液RSD為2.784%（＜3.000%），表明重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性 供試品溶液在室溫下放置12 h后RSD為2.708%（＜3.000%），表明該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 HCPT在不同有機溶劑中的平衡溶解度 HCPT在N，N?二甲基甲酰胺中的平衡溶解度最高，二甲基亞砜次之。氯仿和乙酸乙酯對HCPT的平衡溶解度均很低，但氯仿加入無水乙醇后平衡溶解度大幅度升高。不同體積分數(shù)的乙醇溶液對HCPT的平衡溶解度也不一樣，溶解度隨體積分數(shù)的提高而升高。平衡溶解度從高至低分別為N，N?二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、氯仿?無水乙醇（7∶3）、甲醇、30% 乙醇、20% 乙醇、乙酸乙酯、氯仿、10%乙醇。見表2。

表2 HCPT在不同有機溶劑的平衡溶解度（±s，μg/mL，n=3）

表2 HCPT在不同有機溶劑的平衡溶解度（±s，μg/mL，n=3）

平衡溶解度766.156±0.019 7.677±0.153 1 372.361±0.012 1 406.130±0.016 7.679±0.068 1 674.477±0.032 5.015±0.047 15.183±0.028 53.845±0.015有機溶劑甲醇氯仿氯仿?無水乙醇（7∶3）二甲基亞砜乙酸乙酯N，N?二甲基甲酰胺10%乙醇20%乙醇30%乙醇

2.3 HCPT在不同增溶劑中的平衡溶解度 1%SDS溶液對HCPT的平衡溶解度最高。隨著各增溶劑體積分數(shù)的提高，HCPT的平衡溶解度也隨著升高，其中PEG?400、PEG?4000、甘油的升高趨勢不明顯，RH?40、SDS 則具有明顯的升高趨勢。平衡溶解度從高至低分別為SDS、RH?40、吐溫?80、PEG?4000、甘油、泊洛沙姆 F?68、PEG?4000，見表3。

表3 HCPT在不同增溶劑的平衡溶解度（±s，μg/mL，n=3）

表3 HCPT在不同增溶劑的平衡溶解度（±s，μg/mL，n=3）

增溶劑名稱吐溫?80 PEG?400 PEG?4000 F?68甘油RH?40 SDS平衡溶解度0.1%2.055±0.023 1.372±0.045 2.266±0.017 1.482±0.036 1.937±0.039 1.647±0.056 2.532±0.033 0.5%2.536±0.042 1.494±0.025 2.367±0.035 1.819±0.058 1.996±0.018 3.789±0.048 26.930±0.046 1.0%5.216±0.018 1.564±0.038 2.556±0.024 2.011±0.017 2.075±0.045 6.055±0.025 60.853±0.016

3 討 論

本研究應(yīng)用HPLC建立了HCPT的含量測定方法，確定了HCPT的高效液相條件，方法學(xué)考察表明，該方法專屬性良好，精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的RSD均小于3.000%，適用于HCPT原料藥及相關(guān)制劑的分析檢測。繪制HCPT紫外吸收光譜圖時HCPT在266、384nm處均有強度相近的吸收。因許多溶劑與藥用輔料在200 nm附近有明顯吸收而造成末端吸收干擾，故選擇384 nm為檢測波長，與大多數(shù)文獻報道結(jié)果一致[8?9]。

平衡溶解度是指在一定條件下藥物在某一溶劑中達到飽和狀態(tài)所溶解的最大量，是反映藥物溶解性能的物理參數(shù)[11]。本研究采用氣浴振蕩法，檢測了HCPT的平衡溶解度，該方法可促進藥物分子熱運動，縮短達到溶解平衡的時間[12]，且操作簡單。HCPT為難溶性藥物，脂溶性弱，水溶性極差。難溶性問題不僅會限制其在臨床的應(yīng)用，給其新劑型的研發(fā)帶來困難[13]，還會影響藥物的溶出，降低其生物利用度。近年來，越來越多的學(xué)者研究了HCPT脂質(zhì)體、納米粒、微乳等制劑，試圖提高HCPT的溶解度，增強穩(wěn)定性，提高生物利用度，實現(xiàn)靶向性輸送[14?16]。本研究比較了HCPT在不同有機溶劑和增溶劑中的平衡溶解度，為該藥物新劑型的處方設(shè)計、工藝研究、釋藥實驗等提供了有力依據(jù)。

參考文獻

[1]ZHANGY，SONGWJ，ZHANGFQ，etal.Differentiation?inducingactivity of hydroxycamptothecin on cancer stem?like cells derived from hepato?cellular carcinoma[J].Dig Dis Sci，2011，56（8）：2473?2481.

[2]GUO S，ZHENG J，DONG J，et al.Iron/dextran sulfate multilayered microcapsules for controlled release of 10?hydroxycamptothecin[J].Int J Biol Macromol，2011，49（3）：409?415.

[3]FU YR，YI ZJ，YAN YR，et al.Hydroxycamptothecin?induced apoptosis in hepatoma SMMC?7721 cells and the role of mitochondrial pathway[J].Mitochondrion，2006，6（4）：211?217.

[4]鄭曉龍.抗腫瘤藥物喜樹堿的研究進展[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8（19）：245?246.

[5]王蓉，胡巍，方蕓.羥基喜樹堿的藥學(xué)研究進展[J].藥學(xué)與臨床研究，2015，23（2）：156?159.

[6]PU X，SUN J，WANG Y，et al.Development of a chemically stable 10?hydroxycamptothecin nanosuspensions[J].Int J Pharm，2009，379（1）：167?173.

[7]侯建成，劉洋，魏雪苗，等.羥基喜樹堿臨床抗腫瘤作用研究進展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2017，38（4）：282?285.

[8]肖祎云.羥基喜樹堿包合物脂質(zhì)體的制備及體外抗腫瘤作用研究[D].長沙：中南大學(xué)，2013.

[9]吳先闖，郝海軍，劉瑜新，等.羥基喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體和油制劑生物利用度的比較 [J].中國藥學(xué)（英文版），2015，24（12）：780?788.

[10]袁禮，鐘思雨，周容，等.HPLC法測定斑蝥素的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)[J].中國新藥雜志，2017，26（10）：1185?1188.

[11] 周臻，楊俊騰 .5，7，3′，4′，5′?五甲氧基黃酮平衡溶解度及油水分配系數(shù)的測定[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2017，33（3）：294?298.

[12]袁飛，何琳，丁沐淦，等.靜態(tài)法與動態(tài)法測定藥物水中溶解度的探討[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2010，26（5）：462?465.

[13]SHETH P，SANDHU H，SINGHAL D，et al.Nanoparticles in the phar?maceutical industry and the use of supercritical fluid technologies for nanoparticle production[J].Curr Drug Deliv，2012，9（3）：269?284.

[14]陳建，劉晨，羅淑月，等.羥基喜樹堿制劑研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（11）：180?181.

[15]馬萍，金武龍，馬麗萍.羥基喜樹堿納米靶向給藥系統(tǒng)的研究進展[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志，2015，4（3）：185?189.

[16]張磊，張澤國，王京.喜樹堿衍生物的抗腫瘤研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（11）：1830?1837.