雌激素受體基因多態性與絕經后婦女腱鞘炎關系的研究*

黃愛軍，汪曾榮△，陳麗萍，馬樹強，陳瑞云，陸學東，林昆，黃醒中，陳庠侖（.中山大學附屬第八醫院（深圳福田）骨科，廣東深圳58033；.深圳市福田區第二人民醫院腎內科，廣東58049）

腱鞘炎是女性多發病，目前認為，主要發病原因是腱鞘因機械性摩擦而引起的慢性無菌性炎癥改變，與長期慢性勞損、先天性肌腱異常、類風濕關節炎、內分泌紊亂等有關[1?2]。但哺乳期或更年期婦女發病率高于其他女性，這2類人群均伴雌激素水平的顯著變化，是否說明雌激素在婦女腱鞘炎發病中可能起著重要的作用？雌激素通過與雌激素受體（ER）結合而發揮生物學效應，而ER基因具有多態性和變異性的特點，不同亞型的基因可能與不同的女性高發性疾病有關，如骨質疏松、類風濕關節炎等[3]。目前，國內外尚無有關ER基因多態性與女性腱鞘炎關聯性的研究。因此，通過分析ER基因多態性與腱鞘炎的關系，進一步深化對女性腱鞘炎發病機制的探討，具有重要的指導意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2012年8月至2015年12月中山大學附屬第八醫院門診收治的絕經期女性111例，均為絕經1年以上。按患病情況分為A組（腱鞘炎患者）48例，年齡 46～71歲，平均（58.8±5.6）歲；平均絕經年限（8.75±4.97）年。B組（絕經期健康女性）63例，年齡52～72歲，平均（61.4±4.8）歲；平均絕經年限（11.35±5.78）年。另選取63例非絕經期健康女性（C組）作為健康對照組，年齡 22～47歲，平均（35.3±6.6）歲。本研究經醫院倫理委員會審查通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2 排除標準 （1）過早絕經（≤40歲）；（2）有卵巢切除術史；（3）有ER相關疾病史，如卵巢癌、乳腺癌、類風濕關節炎、骨質疏松等；（4）有肝、腎及內分泌疾病和自身免疫性疾病；（5）檢測期間服用激素或避孕藥，或選擇性ER調節劑。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 采集所有研究對象早上8：00～9：00空腹狀態下外周靜脈血4 mL置于乙二胺四乙酸抗凝試管中，分離白細胞并采用酚/氯仿法提取基因組DNA（美國Promega公司提供試劑盒），純化后?30℃低溫保存。

1.2.2 引物設計

1.2.2.1 檢測技術 采用聚合酶鏈反應（PCR）?限制性片段長度多態性技術。

1.2.2.2 引物 參照文獻[4]設計引物，用于研究的ER?α基因XbaⅠ和PvuⅡ酶切位點多態性引物系列由上海英駿生物工程技術服務有限公司（Invitrogen）合成，上游：5′?CTGCCACCCTATCTTTTCCTATTCTCC?3′，下游：5′?TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATATCTGA?3′。PCR主要試劑由立陶宛Fermentas公司提供；DNA片段長度標準（PCR Markers?Ⅲ）由北京天為時代科技有限公司提供；XbaⅠ和PvuⅡ限制性內切酶為美國Promega公司提供；

1.2.2.3 凝膠電泳 采用1%西班牙瓊脂糖凝膠。

1.2.3 PCR反應 PCR擴增反應體系為25μL，其中基因組 DNA 0.1 μL，10 mmol/L Tris?HCl（pH=9.0），50 mmol/L KCl，1%Triton X?100，2.5 mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，0.25μmol/L的引物，300 ng模板DNA和2.0 U Taq DNA聚合酶。擴增條件：94℃預變性5 min，94 ℃ 變性 30 s，61 ℃ 退火 4 s，72 ℃ 延伸 90 s，共30個循環，最后72℃延伸10 min。擴增片段長度為1.3 kb，PCR擴增產物包括ER基因的1個內含子和2個外顯子。

1.2.4 擴增產物限制性酶切及凝膠電泳分析 將PCR產物20μL分別用5 U XbaⅠ和PvuⅡ限制性內切酶進行酶切消化3 h，酶切產物在含0.5 mg/L溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠中以110 V穩壓電泳30 min，用紫外線凝膠成像系統觀察結果。在1.3 kb片段中檢測XbaⅠ和PvuⅡ的多態性部位。

1.3 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，采用Pearson相關性分析；采用雙側檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCR及酶切結果 根據XbaⅠ限制性內切酶酶切消化將ER分為存在XbaⅠ酶切位點和不存在XbaⅠ酶切位點2類；存在XbaⅠ酶切位點者分為xx型和雜合子Xx型，其中xx型位于910、390bp；Xx型位于1.3kb，910、390 bp；不存在XbaⅠ酶切位點者為XX型，位于1.3 kb；PvuⅡ限制性內切酶酶切消化將ER分為存在PvuⅡ酶切位點和不存在PvuⅡ酶切位點2類；存在PvuⅡ酶切位點者分為純合子pp型和雜合子Pp型，其中pp型位于 850、450 bp；Pp 型位于 1.3 kb，850、450 bp；不存在PvuⅡ酶切位點者為PP型，位于1.3 kb。見圖1。

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圖1 不同酶切電泳ER基因分型

2.2 三組研究對象ER基因分型及頻率比較 三組研究對象基因型分布均符合Hardy?Weinberg定律，具有群體代表性。A、B組研究對象中均無XX型者，C組研究對象中XX型3例（因例數太少，故未對此基因型進行比較）。三組研究對象ER基因型分布中均以PP型出現的頻率最低，但組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1、2，圖2、3。

表1 A、B組研究對象ER基因分型及頻率比較

表2 A、C組研究對象ER基因分型及頻率比較

2.3 三組研究對象ER基因多態性比較 A、B組研究對象均無 XXPP、XXPp、XXpp、Xxpp型者，A、B 組研究對象ER基因多態性中XxPP、xxPP、xxPp型出現頻率較低，但組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖4。A、C 組研究對象均無 XXPp、XXpp、Xxpp 型者，A組患者中XxPP、xxPP型各3例，而C組研究對象中無相應基因型者，且C組研究對象中XXPP型3例，但A組患者中無 XXPP型者，故未對 XxPP、xxPP、XXPP型進行比較；C組研究對象ER基因多態性中xxPp型出現頻率較低，但與A組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4、圖5。

圖2 A、B組研究對象ER基因型分布比較

圖3 A、C組研究對象ER基因型分布比較

表3 A、B組研究對象ER基因多態性比較

圖4 A、B組研究對象ER基因多態性比較

表4 A、C組研究對象ER基因多態性比較

圖5 A、C組研究對象ER基因多態性比較

3 討 論

腱鞘炎是臨床常見病、多發病，病情較輕者表現為患處疼痛，病情較重者伴患指活動受限，使患者生活及工作均受到嚴重影響[5]。

目前認為，主要是因腱鞘反復受機械性摩擦而引起的慢性無菌性炎癥。機械性摩擦刺激導致腱鞘發生充血、水腫、滲出等無菌性炎性反應，反復發生的炎性反應使纖維結締組織發生增生、肥厚、粘連等變化，從而導致“骨?纖維隧道”狹窄，進而壓迫本已水腫的肌腱，使肌腱變性，從而使患指出現疼痛、活動障礙等臨床表現。但腱鞘炎發病的真正病因尚未闡明，是由單因素引發，還是多因素共同作用的結果臨床醫生尚未達成共識。

腱鞘炎患者男女比例為10∶1，尤其是哺乳期或更年期女性發病率更高。很多學者通過長期觀察發現，妊娠、哺乳和絕經后女性腱鞘炎發病率明顯升高，提示性激素，特別是雌激素在腱鞘炎發病中可能具有重要作用[6?7]。

人ER由595個氨基酸殘基組成，相對分子質量為67×103。按受體所在部位分為核性ER（包括ERα和ERβ）[8]和膜性 ER（GPER1、Gap?ER、ER?X）[9?10]。人 ER基因位于6號染色體長臂2區4帶至6號染色體長臂2區7帶這一區間，包括8個外顯子和7個內含子[11]。1號內含子中有2處可以發生點突變，由于這2處點突變發生在限制性內切酶XbaⅠ和PvuⅡ的識別位點上，因此，對ER基因的擴增片段進行酶切便可以區分ER的不同基因型。不同的基因型有可能決定不同個體ER的表達水平和功能的差異，從而影響體內雌激素的生物學作用[8]。

本研究橫向比較了絕經期腱鞘炎患者與絕經期健康女性及非絕經期健康女性ER基因型及多態性分布情況，探討了ER基因型與絕經后婦女腱鞘炎發病的關系。結果表明，A組患者ER基因型分布中Xx、xx、PP、Pp、pp 型分別占 43.750%、56.250%、12.500%、50.000%、37.500%，B組研究對象分別占 42.857%、57.143%、19.048%、47.619%、33.333%，C組研究對象分別占 42.857%、52.381%、4.762%、57.143%、38.095%，三組研究對象ER基因型分布中均以PP型出現的頻率最低，但組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。所以，雖然PP型出現頻率較低，但尚不能認為其是腱鞘炎的低患病基因（保護基因）。

本研究結果顯示，A組患者ER基因多態性中XxPP、XxPp、xxPP、xxPp、xxpp 型分別占 6.250%、37.500%、6.250%、12.500%、37.500%，B組研究對象分別占9.524%、33.333%、9.524%、14.286%、33.333%；C組研究對象 ER基因多態性中 XxPp、xxPp、xxpp型分別占42.857%、14.286%、38.095%；A、B組研究對象ER基因多態性中XxPP、xxPP、xxPp型出現頻率較低，C組研究對象ER基因多態性中xxPp型出現頻率較低，但組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。所以，雖然 XxPp、xxpp型出現頻率較高，尚不能認為XxPp、xxpp型為絕經后女性腱鞘炎的易感基因（患病基因）。

由于本研究只對核性ER進行了分析，且研究對象樣本量相對較少，研究結果可能存在一定的偏倚。目前，對膜性ER的研究發現，膜性ER在女性相關疾病的發生、發展中同樣具有非常重要的作用[9，11]。對女性腱鞘炎在哺乳期及絕經期高發的現象尚需進行大樣本、多中心協作的更深入研究，才能為女性腱鞘炎的防治提供更有力的指導。

參考文獻

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