普伐他汀預處理對香煙提取物誘導的小鼠血管平滑肌細胞凋亡的影響及可能機制研究

廖思聰，祁春雷，王大新

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病發生發展的主要病理基礎，其特征性病理改變是AS斑塊形成。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）在維持血管穩態方面具有重要作用。既往研究結果顯示，凋亡或壞死的VSMCs是構成AS斑塊最重要的成分之一，但AS形成過程較為復雜，具體機制尚未完全闡明［1-4］。吸煙是心血管疾病明確的獨立危險因素之一，但其確切作用機制至今尚未完全闡明［5-6］。他汀類藥物是治療心血管疾病的常用藥物之一，具有調脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多重作用［7-8］，其是否對吸煙引起的血管損傷具有保護作用目前尚不清楚。本研究旨在探討普伐他汀預處理對香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）誘導的小鼠VSMCs凋亡的影響及可能機制，為臨床有效防治AS提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 Bcl-2抗體和Chop抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Bax抗體和GRP78抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體、普伐他汀和4-苯基丁酸（4-PBA）購自美國Sigma Aldrich公司，胎牛血清、DMEM培養基購自美國Hyclone公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國Merck Millipore公司，ECL顯影試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，紅金龍香煙購自湖北中煙工業有限公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物公司，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司，Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒購自北京康為世紀生物技術公司，RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及聚合酶鏈反應（PCR）擴增試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.1.2 主要儀器 BD FACSCalibur流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司；Tecan M2000多功能酶標儀購自美國Tecan公司；ChemiDoc XRS化學發光成像分析系統購自美國Bio-Rad公司，Step One Plus實時熒光定量PCR系統購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 制備 CSE 2017年 6月—2018年 1月，參照DAMICO等［9］的實驗方法制作負壓吸引裝置，制備本實驗所需的CSE，具體如下：1支香煙包含焦油10.0 mg、尼古丁0.9 mg，使用50 ml針筒通過負壓吸引裝置將煙霧抽吸入盛有20 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）的密閉燒瓶內，持續抽吸3～5 min直至香煙燃盡。抽吸完畢后將溶液經0.22 μm孔徑濾器過濾除菌，即得到濃度為100%的CSE原液，在CSE原液中加入DMEM培養基分別配制含1%、5%、10% CSE的DMEM培養基，配制好的培養基須在30 min內用于實驗。

1.2.2 細胞培養 小鼠VSMCs由南京醫科大學病理生理學系惠贈，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、含5%二氧化碳（CO2）的細胞培養箱中常規培養。采用0.25%胰酶消化傳代，取10代以內生長狀態良好的對數期細胞進行實驗。

1.2.3 實驗分組 （1）將實驗細胞分為不同濃度CSE誘導組，其中空白組使用不含CSE的DMEM培養基培養12 h，低濃度組、中濃度組、高濃度組分別于含1%、5%、10% CSE的DMEM培養基培養12 h。（2）將實驗細胞分為不同劑量普伐他汀預處理組，其中對照組使用不含普伐他汀的DMEM培養基培養12 h；低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予1 μM、10 μM、100 μM普伐他汀預處理2 h，然后使用含5% CSE的DMEM培養基培養12 h；部分實驗設置陽性對照組，陽性對照組細胞給予4-PBA 2 mM預處理2 h，然后使用含5% CSE的DMEM培養基培養12 h。

1.3 流式細胞術 嚴格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，根據細胞凋亡時細胞膜內側磷脂酰絲氨酸外翻于細胞膜外側的原理分析細胞凋亡情況，具體如下：消化收集細胞后，調整細胞密度約為5×105個/ml，4℃、1 000 r/min離心5 min，預冷PBS漂洗細胞2次；棄上清，將細胞重懸于100 μl Binding Buffer，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI充分混勻，室溫避光反應15 min，隨后加入400 μl PBS，30 min內采用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4 實時熒光定量 PCR 采用 Primer Premier 5.0 軟件設計各目的基因及內參基因GAPDH的引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成引物。各引物序列如下：Bcl-2正向引物：5'-CCAGGACGTCTCCTCTCAGG-3'，反向引物：5'-AAGATGGTGATGGGCTTCCCG-3'；Bax正向引物：5'-CGTGAGCG GCTGCTTGTCTG-3'，反向引 物：5'-TGGTGAGCGAGGCGGTGAG-3'；GRP78正向引物：5'-GCGTCGGTGTGTTCAAGAAC-3'，反向引物：5'-AAGGGTCATTCCAAGTGCGT-3'；Chop正向引物：5'-CCAACAGAGGTCACACGCACATC-3'，反向引物：5'-TCGTTCTCCTGCTCCTTCTCCTTC-3'；GAPDH正 向 引 物：5'-TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC-3'，反向引物：5'-AAGATGGTGATGGGCTTCCCG-3'。參照總RNA提取試劑盒操作說明提取細胞總RNA，采用cDNA合成試劑盒合成cDNA，隨后加入SYBR Green試劑并經Step One Plus實時熒光定量PCR系統檢測分析，最后通過擴增曲線、溶解曲線及各目的基因CT值確認擴增反應。以GAPDH作為內參基因，采用2-??CT法計算各目的基因mRNA相對表達量。

1.5 Western Blot 嚴格按照RIPA蛋白提取試劑盒說明書進行操作，每孔加入200 μl含1%蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，冰上充分裂解10 min后，4 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測各目的蛋白濃度。將蛋白樣本與5 X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min使蛋白充分變性，置于-20 ℃冰箱中保存。每孔總蛋白上樣量為30 μg，使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電轉至PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉2 h。分別采用Bcl-2抗體（1:1 000）、Bax抗體（1:1 000）、GRP78抗體（1:1 000）、Chop抗體（1:1 000）和β-actin抗體（1:3 000）于4 ℃孵育過夜，次日用含0.1%吐溫-20的PBS（簡稱PBST）溶液洗膜3次，對應的HRP標記二抗室溫孵育1 h，PBST溶液洗膜3次后經ChemiDoc XRS化學發光成像分析系統檢測各條帶灰度值。以β-actin作為內參蛋白，各目的蛋白與內參蛋白灰度值比值即為目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度CSE誘導組細胞凋亡率比較 流式細胞術檢測結果顯示，空白組細胞凋亡率為（6.13±1.71）%，低 濃 度 組 為（14.20±1.53）%， 中 濃 度 組 為（24.18±2.44）%，高濃度組為（30.64±2.52）%。不同濃度CSE誘導組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=80.11，P＜0.05）；低濃度組、中濃度組和高濃度組細胞凋亡率高于空白組，中濃度組和高濃度組細胞凋亡率高于低濃度組，高濃度組細胞凋亡率高于中濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖1）。

礦粒在螺旋槽內分選主要受水流運動特性影響。在弱紊流作用下礦粒在螺旋溜槽內松散和分層。重顆粒集中在下層，并與槽體接觸，在上部物料的壓力下，其運動阻力大；而處在上部流動層的輕顆粒所受阻力較小，因此增大了上下層之間流動速度差。輕礦物顆粒位于縱向流速高的上層流中，所受離心力較大，同時受到橫向環流給予的向外的流體動壓力，這兩種力的合力大于顆粒的重力分力和摩擦力，所以輕礦物顆粒向槽的外緣移動；與之相反重礦物顆粒富集于內緣。礦粒在螺旋面上的分帶如圖4所示[9]。

圖1 不同濃度CSE誘導組流式細胞圖Figure 1 Flow cytometry results of VSMCs with different induction concentrations of CSE

2.2 不同濃度CSE誘導組細胞凋亡相關蛋白表達情況比較 不同濃度CSE誘導組Bcl-2、Bax mRNA和蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。低濃度組、中濃度組和高濃度組Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量低于空白組，中濃度組和高濃度組Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量低于低濃度組，高濃度組Bcl-2蛋白相對表達量低于中濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低濃度組、中濃度組和高濃度組Bax mRNA和蛋白相對表達量高于空白組，中濃度組和高濃度組Bax mRNA和蛋白相對表達量高于低濃度組，高濃度組Bax mRNA相對表達量高于中濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 不同濃度CSE誘導組內質網應激（ERS）途徑相關蛋白表達情況比較 不同濃度CSE誘導組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；低濃度組、中濃度組、高濃度組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達量高于空白組，中濃度組、高濃度組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達量高于低濃度組，高濃度組GRP78 mRNA、Chop蛋白相對表達量高于中濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表 2）。

表1 不同濃度CSE誘導組細胞凋亡相關蛋白表達情況比較（）Table 1 Comparisons of relative quantity expression of apoptosis-related protein of VSMCs with different induction concentration of CSE

表1 不同濃度CSE誘導組細胞凋亡相關蛋白表達情況比較（）Table 1 Comparisons of relative quantity expression of apoptosis-related protein of VSMCs with different induction concentration of CSE

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低濃度組比較，bP＜0.05；與中濃度組比較，cP＜0.05

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表2 不同濃度CSE誘導組ERS途徑相關蛋白表達情況比較（）Table 2 Comparisons of relative quantity expression ERS pathway related proteins of VSMCs with different induction concentration of CSE

表2 不同濃度CSE誘導組ERS途徑相關蛋白表達情況比較（）Table 2 Comparisons of relative quantity expression ERS pathway related proteins of VSMCs with different induction concentration of CSE

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低濃度組比較，bP＜0.05；與中濃度組比較，cP＜0.05

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2.4 不同劑量普伐他汀預處理組細胞凋亡率比較流式細胞術檢測結果顯示，對照組細胞凋亡率為（26.63±1.92）%，低劑量組為（21.31±2.25）%，中劑量組為（16.51±2.43）%，高劑量組為（22.67±1.37）%。不同濃度CSE誘導組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=80.11，P＜0.05）；低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞凋亡率低于對照組，中劑量組細胞凋亡率低于低劑量組和高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 不同劑量普伐他汀預處理組流式細胞圖Figure 2 Flow cytometry results of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

2.5 不同劑量普伐他汀預處理組細胞凋亡相關蛋白表達情況比較 不同劑量普伐他汀預處理組Bcl-2和Bax蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組、中劑量組、高劑量組Bcl-2蛋白相對表達量高于對照組，Bax蛋白相對表達量低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；中劑量組Bax蛋白相對表達量低于低劑量組和高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 不同劑量普伐他汀預處理組細胞凋亡相關蛋白表達情況比較（）Table 3 Comparisons of relative quantity expression of apoptosis-related protein of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

表3 不同劑量普伐他汀預處理組細胞凋亡相關蛋白表達情況比較（）Table 3 Comparisons of relative quantity expression of apoptosis-related protein of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

注：與對照組比較，aP＜0.05；與中劑量組比較，bP＜0.05

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2.6 不同劑量普伐他汀預處理組ERS途徑相關蛋白表達情況比較 不同劑量普伐他汀預處理組GRP78、Chop蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組GRP78和Chop蛋白相對表達量低于對照組，低劑量組、中劑量組、高劑量組GRP78蛋白相對表達量低于陽性對照組，中劑量組GRP78蛋白相對表達量低于低劑量組、Chop蛋白相對表達量低于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表 4）。

表4 不同劑量普伐他汀預處理組ERS途徑相關蛋白表達情況比較（）Table 4 Comparisons of relative quantity expression of ERS pathway related proteins of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

表4 不同劑量普伐他汀預處理組ERS途徑相關蛋白表達情況比較（）Table 4 Comparisons of relative quantity expression of ERS pathway related proteins of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

注：與對照組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

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3 討論

VSMCs是維持血管穩態最主要的細胞，其功能異常可促進AS等慢性炎性疾病發生發展，但既往研究主要集中在VSMCs增殖、遷移及表型轉化等病理生理機制。近年研究表明，VSMCs凋亡在心肌梗死、腦卒中、肺動脈高壓等發生發展中均具有重要作用［10-12］。凋亡的VSMCs可在局部組織釋放白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）等細胞因子，引發炎性反應，促進易損斑塊和壞死核心形成，加速血管衰老及鈣化形成［13-14］，直接或間接導致血管穩態失衡，可能參與AS的發生發展［15-16］。

吸煙是公認的心血管疾病獨立危險因素，也是肺部疾病的重要致病因素。香煙暴露能引起炎性反應、氧化應激和補體激活等病理生理改變，還可直接導致肺上皮細胞凋亡［9，17］。YANG等［18］研究發現，CSE可通過多種細胞機制促進AS形成、發展，包括氧化應激、脂質紊亂及血管炎癥等。本研究通過CSE模擬香煙暴露對VSMCs凋亡的影響，結果顯示，低濃度組、中濃度組和高濃度組細胞凋亡率及Bax mRNA、蛋白相對表達量高于空白組，Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量低于空白組；中濃度組和高濃度組細胞凋亡率及Bax mRNA、蛋白相對表達量高于低濃度組，Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量低于低濃度組；高濃度組細胞凋亡率和Bax mRNA相對表達量高于中濃度組，Bcl-2蛋白相對表達量低于中濃度組；提示CSE可誘導小鼠VSMCs凋亡，下調具有抗凋亡作用的Bcl-2 mRNA和蛋白表達，上調具有促凋亡作用的Bax mRNA和蛋白表達，且呈濃度依賴性。既往研究表明，各種原因所致細胞內外環境紊亂均可引發ERS，其中GRP78和Chop是ERS標志信號分子，Chop表達上調可激活Bcl-2蛋白家族，而后者能促進線粒體依賴細胞凋亡，進而參與AS形成［19］。本研究結果顯示，低濃度組、中濃度組、高濃度組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達量高于空白組，中濃度組、高濃度組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達量高于低濃度組，高濃度組GRP78 mRNA、Chop蛋白相對表達量高于中濃度組，提示CSE作用于VSMCs后可上調ERS標志信號分子GRP78和Chop表達，且呈濃度依賴性，故筆者推測香煙暴露可能通過ERS途徑誘導VSMCs凋亡。

他汀類藥物除具有較強的調脂作用外，還具有抗炎、抗血栓、抗氧化應激等多重作用。LI等［20］研究發現，阿托伐他汀可降低小鼠血管組織中血管緊張素Ⅱ誘導的GRP78、Chop表達及TUNEL染色陽性凋亡細胞數量。體外實驗結果顯示，血管緊張素Ⅱ可介導ERS途徑的VSMCs和巨噬細胞凋亡，而辛伐他汀可部分抑制上述過程，表現為Chop、Caspase 12、GRP78等蛋白表達降低。ZHANG等［21］研究結果顯示，瑞舒伐他汀可有效降低移植到小鼠心臟的脂肪源性間充質干細胞凋亡率，上調Bcl-xL和Bcl-2等抗凋亡蛋白表達，并下調Bim和Bax等促凋亡蛋白表達，提示他汀類藥物可能在多種組織細胞中具有抗凋亡作用。但也有研究顯示，他汀類藥物在腫瘤細胞中具有促凋亡作用［22-23］，提示他汀類藥物對細胞凋亡的保護作用可能與細胞凋亡誘導因素、他汀類藥物種類及細胞類型等有關［24］。本研究結果顯示，低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞凋亡率低于對照組，中劑量組細胞凋亡率低于低劑量組和高劑量組；低劑量組、中劑量組、高劑量組Bcl-2蛋白相對表達量高于對照組，Bax蛋白相對表達量低于對照組；中劑量組Bax蛋白相對表達量低于低劑量組和高劑量組；提示普伐他汀預處理可有效降低CSE誘導的小鼠VSMCs凋亡率、上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達及下調促凋亡蛋白Bax表達，且采用10 μM普伐他汀預處理的抗凋亡作用最佳。本研究結果還顯示，陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組GRP78和Chop蛋白相對表達量低于對照組，低劑量組、中劑量組、高劑量組GRP78蛋白相對表達量低于陽性對照組，中劑量組GRP78蛋白相對表達量低于低劑量組、Chop蛋白相對表達量低于陽性對照組；提示普伐他汀預處理可下調ERS標志信號分子GRP78和Chop蛋白的表達，推測他汀類藥物抗細胞凋亡作用可能與調控ERS信號途徑有關。

作者貢獻：王大新進行實驗設計，論文審校并對文章負責；廖思聰進行實驗實施，資料收集整理，負責撰寫論文；祁春雷進行實驗評估，數據統計分析。

本文無利益沖突。

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