水蒸氣蒸餾和超臨界萃取來鳳鳳菊精油抗氧化研究

邢玉娟，陳新，劉梁，章慧，邱濰，周若蘭

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

植物精油是植物體內的次生代謝物質，一般采用物理方法從芳香植物的花、草、葉、枝、皮、根、莖、果實、種子或分泌物中提取出來的具有一定香氣和揮發性的油狀物質[1]。目前提取植物精油的方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法、吸附法、超臨界流體萃取法、微波輔助提取法、酶解輔助提取法、亞臨界水提法等[2]。植物精油是一類天然植物性添加劑，能夠矯正食品的異味，賦予香氣，具有著色、抗菌消炎、防腐、抗氧化、抗腫瘤等作用[3]。因此，植物精油常被開發成天然防腐劑和殺菌劑，廣泛應用在肉制品、果蔬制品、乳制品、水產品、焙烤制品等食品行業中[4]。

來鳳鳳菊又名神農香菊Dendranthelnaindicum（L.），產于湖北恩施來鳳縣，系菊科菊屬（Dendranthema）的一個新變種植物，全株具有特殊的濃郁香氣，具有疏風清熱、平肝明目、散風降壓等功效[5]。來鳳鳳菊作為菊科菊屬新變種藥材，其所含香氣成分是天然香精香料的重要組成部分，提取的精油可以被廣泛應用于食品加工、化妝品等行業。因其所含化學成分復雜，國內外學者對其化學成分及含量不斷地進行深入研究，但是對來鳳鳳菊資源的開發應用等研究仍然需更加深入的探索[6]。本文采用水蒸氣蒸餾法（steam distillation，SD）和超臨界二氧化碳萃取法（supercriticalCO2fluid extraction，SFE）來提取來鳳鳳菊精油，通過5個抗氧化體系來比較這兩種提取方法提取的來鳳鳳菊精油的抗氧化能力，為來鳳鳳菊資源的綜合開發利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來鳳鳳菊：湖北來鳳騰升香料公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）：凱瑪生化有限公司；沒食子酸丙酯（Propylgallatum，PG）：上海笛柏化學品技術有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-Tri（2-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ）：上海源葉生物科技有限公司；2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（2，2’-Azino-bis（3-ethylben zothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS）：Sigma公司；2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）：賽歐飛世爾科技有限公司；DMEM培養基：HyClone公司；磷酸氫二鈉、乙酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀：天津市博迪化工有限公司；氯化鐵：天津市雙船化學試劑廠；過硫酸鉀：天津天力化學試劑有限公司；冰乙酸：天津永晟精細化工有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；其它所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

頂空氣相色譜-質譜聯用儀、Agilent HP-INNOWax毛細管色譜柱：安捷倫公司；HA221-50-06-C超臨界CO2萃取儀：江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；高速萬能粉粹機：天津泰斯特儀器有限公司；Lambda25紫外分光光度計：美國珀金埃爾默公司；TGL-205臺式高速冷凍離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；揮發油提取裝置：武漢市江漢區泰信玻璃儀器；R-215旋轉蒸發器：Buichi公司；SB25-12DT超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；精密電子天平：梅特勒-托利多公司；摩爾超純水機：重慶摩爾水處理有限公司；數顯恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；BOXUN高壓滅菌鍋：廣州滬瑞明儀器有限公司；ZHJH-1112B超凈工作臺：深圳朗普電子科技有限公司；GOLD-SIM二氧化碳培養箱：西盟國際集團金西盟（北京）有限公司；MDF-86V340醫用低溫保存箱：安徽中科都菱商用電器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 來鳳鳳菊揮發油的提取

1.3.1.1 水蒸氣蒸餾法提取精油（SD精油）

精密稱取來鳳鳳菊粉末200 g，置于2 000mL圓底燒瓶中，加入一定量的超純水，再按《中華人民共和國藥典》2010版Ⅰ部附錄XD揮發油測定法的甲法操作，提取時間為5 h，待提取液冷卻后，加入石油醚萃取3次，得到來鳳鳳菊揮發油提取液，濃縮，經無水硫酸鈉干燥后，冷藏備用。

1.3.1.2 超臨界二氧化碳提取精油（SFE精油）

精密稱取來鳳鳳菊粗粉200g，裝入萃取釜中，設定萃取釜工藝參數：分離罐Ⅰ為40℃，分離罐Ⅱ為25℃，壓力為35MPa，溫度為45℃，流量為20 L/h，萃取時間為2 h。從解析釜出料口出料得黃色黏稠液體，多次收集后冷藏備用。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定

參照沈科萍等的方法[7]，用無水乙醇分別配置濃度為 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL 的 SFE 精油和SD精油，以人工合成抗氧化劑PG作為陽性對照。分別將2.0mL樣品溶液和2.0mL濃度為0.1mmol/L DPPH溶液，混合均勻后暗處放置30min，以無水乙醇作為參比溶液，在517 nm處測定其吸光值A，同時測定2.0 mL樣品溶液與2.0 mL無水乙醇混合后在517 nm處的吸光值A0，再測定2.0mLDPPH溶液和2.0mL無水乙醇混合液在517 nm處的吸光值A1，所有測定平行進行3次取平均值，按下式計算其清除率：DPPH 自由基清除率/%＝[1-（A-A0）/A1]×100。

1.3.3 ABTS+自由基清除率的測定

參考Xican Li等[8]方法，將等體積的7.4 mmol/L ABTS溶液與2.6mmol/L過硫酸鉀溶液混合后置于暗處反應12 h～16 h。用無水乙醇將ABTS溶液稀釋至在734 nm處吸光度為0.70±0.05。用無水乙醇分別配置濃度為 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL 的 SFE 精油和SD精油，以抗氧化劑PG作為陽性對照。將0.2mL不同濃度樣品加入2mLABTS+自由基溶液中，6min后測其吸光度A1。測定2mLABTS+自由基溶液與樣品體積相同乙醇混合后的吸光度A0。所有測定平行進行3次取平均值，按下式計算其清除率：ABTS+自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100

1.3.4 總還原力的測定

參照YeChunlin等[9]方法，取2.5mL不同濃度（0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/mL）的樣品溶液加入到裝有2.5mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/mL，pH=6.6）的具塞試管中，再加入2.5mL 1%K3Fe（CN）6溶液混合均勻，50℃恒溫水浴反應20min，快速冷卻后，加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液終止反應，10 000 r/min離心10min，取上清液 2.5mL，加入 2.5mL 水，0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10min，在700 nm下測吸光度，所有測定平行進行3次，取平均值?？寡趸瘎㏄G作為陽性對照。

1.3.5 鐵還原抗氧化能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP 法）

參照 Katarzyna Szafrańska 等[10]方法，FRAP 工作液的配置：0.3 mol/L 醋酸緩沖溶（pH=3.6）、10 mmol/L 2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）鹽酸溶液和20mmol/L FeCl3，溶液按10∶1∶1體積比配制，現用現配。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L FeSO40.1mL，加入3.9mLFRAP工作液，37℃下水浴30min，以蒸餾水為參比，在593 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程為y=0.308 45x+0.193 12（R2=0.998 75）。分別取 0.1mL 各供試品溶液（0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/mL），同法處理，測定吸光度。樣品的抗氧化能力FRAP值以亞鐵離子（相當于FeSO4）表示（mmol/L）。

1.3.6 清除細胞內活性氧的測定

參照蘇海蘭等[11]方法并稍作修改，取對數生長期的Hela細胞，調整細胞懸液濃度接種于96孔培養板中于37℃、5%CO2培養箱培養24 h。培養完成后將上清液吸除掉，用PBS清洗兩遍，然后加入120μL不同濃度的 SFE 精油（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.25mg/mL）和SD精油（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5mg/mL），再加入 120 μL的10μmol/L的DCFH-DA溶液，混勻后立即用多功能讀板器檢測熒光強度，激發波長為485 nm，發射波長為538 nm，對照組用2.5mmol/L的雙氧水代替樣品，空白組用無水乙醇代替樣品，所有樣品均平行測定3次。

2 結果與討論

2.1 清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是一種穩定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm處有最大吸收[12]。當有供氫能力的抗氧化劑存在時，供氫體被破壞，DPPH溶液的顏色變淺，吸光度值變小，因此可根據吸光度的變化測定抗氧化劑的活性[13]，見圖1。

圖1 不同濃度的SFE精油和SD精油對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging capacity against DPPH radicalsof different concentrationsof SFE and SD essentialoil

如圖1所示，兩種方法提取的來鳳鳳菊精油都有一定清除DPPH自由基的能力，且清除率隨著質量濃度的增加而增大。在相同濃度下，SFE精油清除DPPH自由基的能力要強于SD精油。但與陽性對照PG相比，SFE精油要遠小于PG，0.2mg/mL的PG對DPPH自由基的清除率就達到90%以上。

2.2 ABTS+自由基清除率的測定

ABTS經活性氧氧化后生成穩定的藍綠色陽離子自由基ABTS+，在734 nm處有最大吸收，當ABTS+溶液中加入自由基清除劑，則該物質會與ABTS+發生反應而使反應體系褪色，然后在ABTS+的最大吸光波長（734 nm）下檢測吸光度變化，吸光度變化越大，抗氧化活性越大[14]，見圖 2。

圖2顯示兩種方法提取的鳳菊精油對ABTS+自由基具有良好的清除能力，其清除能力隨著精油質量濃度的升高逐漸增大，當濃度為2.0mg/mL時，SD精油可以清除29.45%的ABTS+自由基，SFE精油可以清除64.82%的ABTS+自由基，SFE精油比SD精油高了35.37%，但與陽性對照PG相比，來鳳鳳菊精油對ABTS+自由基的清除能力要弱于PG，而0.2mg/mL的PG對ABTS+自由基的清除率就達到了100%。

圖2 不同濃度的SFE精油和SD精油對ABTS+自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity againstABTS+radicalsofdifferent concentrationsof SFE and SD essentialoil

2.3 總還原力

利用普魯士藍法測定來鳳鳳菊精油的還原能力，以普魯士藍Fe4[Fe（CN）6]3的生成量作為指標，將[K3Fe（CN）6]還原成[K4Fe（CN）6]，再利用 Fe3+形成普魯士藍，并且在700 nm處有較大吸光峰，因此，可通過顯色反應來判斷還原程度，吸光度越大，表示其還原能力越強，抗氧化能力也越強[15]，見圖3。

圖3 不同濃度的SFE精油和SD精油的總還原能力Fig.3 The total reductive power of different concentrationsof SFE and SD essentialoil

由圖3可以看出，當濃度為0.2mg/mL時，PG的還原力就達到最大值，兩種方法提取鳳菊精油的還原力雖然隨著質量濃度的增大而增大，但其還原力要遠低于陽性對照PG。在相同濃度下，SFE精油的還原力要大于SD精油。

2.4 總抗氧化能力的測定（FRAP法）

FRAP法是在酸性pH的環境中，Fe3+-TPTZ復合物與抗氧化劑反應形成Fe2+-TPTZ復合物使得在波長593 nm處的吸光度值有顯著的變化[16]，該操作簡單，且穩定性好，可以作為測定待測物質總抗氧化能力的一種方法。硫酸亞鐵的標準曲線見圖4，不同濃度的SFE精油和SD精油的總抗氧化能力見圖5。

圖4 硫酸亞鐵的標準曲線Fig.4 Standard curveof ferroussulfate

圖5 不同濃度的SFE精油和SD精油的總抗氧化能力Fig.5 Totalantioxidant capacity of different concentrationsof SFE and SD essentialoil

由圖5可知，兩種精油的總抗氧化能力呈明顯的量效關系，隨著樣品質量濃度的增大，其總抗氧化能力不斷增強。與陽性對照PG相比，SFE精油的總抗氧化能力要遠低于PG，當濃度為0.5mg/mL時，PG的總抗氧化能力達到最大值。但在相同濃度下，SFE精油的總抗氧化能力要強于SD精油。

2.5 清除細胞內活性氧能力

DCFH-DA作為一種氧化指示劑，當其被細胞吸收并被細胞酯酶去脂化生成2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein，DCFH）后，細胞中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）能將其氧化成帶有熒光的二氯熒光黃（dichlorofluorescein，DCF），通過酶標儀進行熒光值測定，以熒光強度來指示細胞內ROS的水平[17-18]。不同濃度的SFE精油清除細胞內活性氧能力見圖6，不同濃度的SD精油清除細胞內活性氧的能力見圖7。

圖6 不同濃度的SFE精油清除細胞內活性氧能力Fig.6 Theability to remove reactiveoxygen speciesof different concentrationsof SFE essentialoil in Hela cells

圖7 不同濃度的SD精油清除細胞內活性氧的能力Fig.7 Theability to remove reactiveoxygen speciesof different concentrationsof SD essentialoil in Hela cells

由圖6、圖7可知，兩種方法提取的來鳳鳳菊精油都具有清除細胞內自由基的作用，且隨著樣品質量濃度的升高，清除的自由基越多，需要的時間也就越短。在相同試驗條件下，0.2mg/mL的SFE精油清除Hela細胞內活性氧的能力是0.4mg/mL的SD精油的1.6倍。因此，超臨界提取的來鳳鳳菊精油對Hela細胞內自由基具有很強的清除作用。

3 結論

采用了5種不同的評價體系對兩種來鳳鳳菊精油的抗氧化活性進行了研究，試驗結果表明，SFE精油具有良好的抗氧化活性。但由于各種評價方法的機理有所差異，同一物質在不同評價體系里可能表現出不同的抗氧化活性，因此在篩選抗氧化劑時用多種方法進行綜合評價是很有必要的[19]。

與水蒸氣蒸餾法相比，超臨界CO2萃取法作為一種新型萃取技術，操作溫度低，且無溶劑殘留，能較完好地保持來鳳鳳菊中有效成分不被破壞，避免不穩定化合物的降解，從而提高其抗氧化活性[20]。因此，用超臨界CO2萃取法提取的來鳳鳳菊精油的抗氧化能力要大于水蒸氣蒸餾法提取的精油。

目前，由于人們生活水平的提高，對綠色天然保健食品的要求越來越高，因此，超臨界CO2萃取法提取的來鳳鳳菊精油作為一種新型綠色天然抗氧劑應用于食品行業具有一定的開發潛力。

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