應用表面活性劑提取玉竹黃酮的工藝研究

夏光輝，梁鈺，韓爽

（1.通化師范學院食品科學與工程學院，吉林通化134002；2.通化師范學院生物制劑國際合作研究中心，吉林通化134002）

玉竹[學名 Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]，別名甜草根、地管子，屬于百合科黃精屬植物[1]。玉竹根莖是藥食兩用材料，含有多糖、黃酮、生物堿、皂苷等成分[2]，具有除煩、止渴的功效[3]，可治熱病傷陰、咳嗽、消谷易虛、勞發熱饑等癥[4-5]。近幾年，玉竹作為一種具有獨特的保健與營養功能的食材受到人們的廣泛關注。黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一類天然色素[6]，是玉竹的重要活性成分。玉竹中的黃酮主要高異黃酮類[7]，具有清除自由基、抗病毒、抑菌、防治心血管疾病等生理功能[8-9]。研究黃酮的生物學活性，必須采取合適的方法對黃酮成分進行提取，天然環保、無殘留的提取方法廣受關注。目前，提取黃酮的方法主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶法提取等[10-11]，各有優缺點，但共性問題是環保程度偏低，提取成本偏高[12]。采用表面活性劑來提取玉竹黃酮的研究尚未有報道。表面活性劑是一類可降低溶液表面張力，具有親水與疏水雙重基團的特殊試劑，具有較強的增溶作用[13-14]。提取液可不經處理，直接采用大孔樹脂來富集黃酮成分，省去有機溶劑提取時的濃縮、冷凝等操作，節省提取成本，提取后的殘余原料經水洗后還可加工利用。常用的聚乙二醇系列和吐溫系列表面活性劑無毒或毒性較低，價格低廉，在樣品中無殘留，對環境無污染，對黃酮類成分具有較好的溶解性。以表面活性劑代替有機溶劑提取玉竹黃酮，能降低提取成本，減小環境污染。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原材料與試劑

玉竹：產于吉林省白山市松江河鎮的新鮮玉竹；聚乙二醇400：沈陽華東試劑廠；吐溫80：天津市科密歐化學試劑有限公司；烷基糖苷、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、平平加：廣州市陽航化工有限公司；蘆丁標準品：上海士鋒生物科技有限公司；D101大孔樹脂：天津市光復精細化工研究所；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：均為分析純。

1.1.2 試驗設備

BNI-A電子天平稱：臺灣巨林櫻花企業；HWS26恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發器：上海亞榮升生化儀器廠；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；SHD-Z（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；T6-紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FE-130藥物粉碎機：上海華巖儀器設備有限公司。

1.2 表面活性劑提取玉竹黃酮的工藝操作方法

1.2.1 表面活性劑提取玉竹黃酮的工藝流程

玉竹根莖→水洗→烘干→粉碎→稱量→表面活性劑溶液提取黃酮→離心→過濾→濾渣二次提取→離心→抽濾→合并提取液→過大孔樹脂柱→水洗→80%醇洗→玉竹黃酮粗提液

1.2.2 操作方法

將玉竹根莖清洗干凈，烘干之后用藥物粉碎機粉碎，過40目篩，得到玉竹粉末。稱取1 000 g玉竹粉末，置入玻璃罐中，加入一定質量分數的表面活性劑水溶液后放入超聲波提取機中，攪拌均勻，于試驗設定溫度下提取一定時間后于5 000 r/min下離心5min，抽濾，得到的殘渣再次加入相同質量分數的表面活性劑水溶液，在相同條件下二次提取。合并兩次提取的濾液。濾液以1mL/min的速度泵入D101大孔樹脂柱，全部過柱后，用5倍～10倍柱體積的蒸餾水洗滌，再用2倍柱體積的80%乙醇溶液洗滌，收集80%乙醇洗液，即為玉竹黃酮粗提液。

1.3 表面活性劑提取玉竹黃酮的試驗方法

1.3.1 適宜表面活性劑種類的確定

對吐溫80、聚乙二醇400、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、烷基糖苷、平平加等分別進行單一種類、兩種和3種復配使用來提取玉竹黃酮，操作時表面活性劑的濃度為 2%，料液比為 1 ∶10（g/mL），超聲提取 20min，提取2次。計算在不同種類表面活性劑下的玉竹黃酮提取率，分析確定最佳表面活性劑種類。

1.3.2 其他單因素試驗

分別進行表面活性劑濃度、適宜料液比、提取時間、提取溫度4個方面的單因素試驗。選取的表面活性劑濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），提取溫度為 20、25、30、35、40、45 ℃，提取時間為 5、10、15、20、25、30min。

1.3.3 表面活性劑提取玉竹黃酮的正交試驗設計

確定表面活性劑種類后，以料液比、提取劑濃度、提取溫度和提取時間為因素，參考單因素試驗最佳結果，各因素各取3個水平，進行正交試驗以確定各因素的最佳組合方式。

1.3.4 玉竹黃酮粗提液中黃酮含量檢測方法

參考溫玲蓉等[15]采用硝酸鋁顯色法繪制蘆丁標準曲線，得到的回歸方程為y=1.052 6x-0.005 1，相關系數R2=0.998 9，線性關系良好。對玉竹黃酮樣品采用硝酸鋁顯色法測定吸光度后，由回歸方程計算樣品溶液中黃酮的含量。

1.3.5 數據統計分析

數據統計分析采用SPSS 17.0統計軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 表面活性劑提取玉竹黃酮單因素試驗

2.1.1 表面活性劑種類的確定

對不同種類的表面活性劑分別進行玉竹黃酮提取試驗，試驗結果見表1。

續表1 不同類型表面活性劑提取玉竹黃酮的提取率Continue table1 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidsw ith different kindsofsurfactants

由表1可知，聚乙二醇400對玉竹黃酮的提取率最大，幾種表面活性劑配合使用沒有提高玉竹黃酮的提取率。不同種類的表面活性劑由于其在水中形成的膠束結構的差異[16]，對黃酮的溶解能力是不同的。試驗數據表明，聚乙二醇400對玉竹黃酮的溶解能力高于其他種類的表面活性劑。為考察幾種表面活性劑復配使用對玉竹黃酮提取率的影響情況，設計了兩種、三種表面活性劑的不同比例復配使用方案，研究結果表明，幾種表面活性劑的復配使用對玉竹黃酮的提取率無影響，效果不比單一種類的好。選擇單一種類的提取劑，不但操作簡單，而且成本更低，對玉竹黃酮的提取效果更佳。確定聚乙二醇400為提取玉竹黃酮的最佳試劑。

2.1.2 提取劑濃度的確定

聚乙二醇400質量分數對玉竹黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 聚乙二醇400質量分數對玉竹黃酮提取率的影響Fig.1 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidsw ith differentmass fraction of polyethyleneglycol400

由圖1可知，聚乙二醇400的質量分數為2%～6%時，玉竹黃酮的提取率隨聚乙二醇400濃度的升高而提高。質量分數大于6%后，玉竹黃酮提取率開始緩慢減小，說明再增大聚乙二醇400的濃度已無意義。當聚乙二醇400濃度達到10%時，溶液黏度明顯上升，不利于玉竹黃酮的溶解和后續黃酮富集過程的進行。確定合適的聚乙二醇400提取劑濃度為6%。

2.1.3 適宜料液比的確定

料液比對玉竹黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對玉竹黃酮提取率的影響Fig.2 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidswith differentsolid-liquid ratio of surfactants

如圖 2 所示，料液比從 1 ∶5（g/mL）到 1 ∶15（g/mL）之間，玉竹黃酮的提取率隨料液比的增大而升高；料液比超過1∶15（g/mL）后，玉竹黃酮的提取率增加幅度較小。增加提取劑用量，隨可小幅度提高玉竹黃酮的提取率，但提取劑聚乙二醇400的用量卻顯著增加，增加了提取成本。同時，提取劑用量越大，后續用大孔樹脂富集玉竹黃酮的時間越長，延長了提取工藝的總時間。可見，選取適宜的料液比會提高玉竹黃酮提取操作過程的經濟效益。料液比為1∶15（g/mL）時提取率較高，同時最省提取溶劑，經濟性最強。

2.1.4 適宜提取溫度的確定

提取溫度對玉竹黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對玉竹黃酮提取率的影響Fig.3 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidswith differentextraction tem perature

在對玉竹黃酮進行提取時，采用了超聲波進行輔助。頻率高于20 kHz的超聲波可加速物質分子的振動，增強傳遞性能，加速可溶成分的擴散和傳播[17]。超聲波還可破壞植物細胞壁，促進細胞內容物的溶出。同時，超聲波還可產生一定程度的熱效應。采用超聲波輔助提取，可顯著縮短提取時間。從圖3可以看出，采用30℃的提取溫度可以達到較高的提取率，再提高溫度，會導致和玉竹黃酮極性相近的雜質快速溶出，對后續操作不利，導致玉竹黃酮的提取率逐漸小幅下降。30℃的提取溫度接近室溫，對黃酮成分的穩定性影響很小，而且提取時容易操作，可利用超聲波自身的產熱效應就可達到，不需要額外加熱。確定適宜的提取溫度為30℃。

2.1.5 適宜提取時間的確定

提取時間對玉竹黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對玉竹黃酮提取率的影響Fig.4 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidsw ith differentextraction tim e

由圖4可以看出，5min～20min內，隨著表面活性劑提取玉竹黃酮時間的延長，玉竹黃酮的提取率逐漸增大；超過20min后，玉竹黃酮的提取率開始減小，可能原因是超聲波導致部分黃酮與雜質發生反應或導致部分黃酮分子發生水解，致使提取率下降。適當延長提取時間，有助于黃酮與聚乙二醇400水溶液的充分接觸，但當提取時間越長，超聲波耗費的能量越多，成本會隨之增大。選取20min的超聲提取時間比較適宜，在此范圍內，玉竹黃酮的提取率已達最高，超聲波導致的提取液溫度升高幅度較小，可容易調控。

2.2 表面活性劑提取玉竹黃酮正交試驗結果

經單因素試驗確定聚乙二醇400為提取玉竹黃酮的最佳試劑，以料液比、提取劑濃度、提取溫度和提取時間為因素進行的L9（34）正交試驗設計見表2，試驗結果見表3。

由表3可以看出，3號試驗的提取率最高，但未必是最佳提取方式組合。對正交試驗結果數據分析可知，影響玉竹黃酮提取率的因素大小為B＞C＞D＞A，即聚乙二醇400濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比。最佳提取方式組合為 A1B3C2D2，即料液比為 1∶10（g/mL），聚乙二醇400質量分數為8%，提取溫度為30℃，提取時間為20min。按照A1B3C2D2條件進行3次平行試驗，玉竹黃酮平均提取率為0.662 7%，高于正交試驗的最高水平。

表2 玉竹黃酮提取工藝正交試驗設計Tab le2 Theorthogonalexperiment design of Polygonatum odoratum flavonoidsextraction p rocess

表3 表面活性劑法提取玉竹黃酮正交試驗結果Tab le3 Theorthogonalexperiment resu ltsof Polygonatum odoratum flavonoidsextraction ratewith surfactants

3 結論

以聚乙二醇400為最適提取劑，對玉竹黃酮的提取工藝進行了研究。通過單因素和正交試驗，確定了表面活性劑提取玉竹黃酮的最佳工藝參數。最佳操作條件為，聚乙二醇400提取劑的濃度為8%，料液比為1∶10（g/mL），提取溫度為 30 ℃，提取時間為 20min，在此條件下玉竹黃酮的提取率可達0.662 7%。使用表面活性劑來提取玉竹黃酮具有成本低、無污染、綠色節能等特點，為更好地研究玉竹黃酮特性和開發玉竹功能食品提供理論參考。

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