黑果腺肋花楸水提物對果蠅抗衰老活性的研究

鄭麗娜，趙大慶，趙文學，劉鈺才，王思明，*

（1.長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心，吉林長春130117；2.吉林省北佳中藥集團股份公司，吉林長春130117）

黑果腺肋花楸（Aroniamelanocarpa）系薔薇科腺肋花楸屬多年生落葉灌木，營養含量豐富，因其具有抗氧化、抗炎、降血糖等多種生物學活性而被廣泛關注[1-2]。已有研究表明，黃酮及酚酸類化合物在黑果腺肋花楸果實中含量極高，成為其藥理活性作用物質基礎研究的主要成分[3-6]。花青素（Anthocyanin）屬于黃酮類化合物，是一類天然水溶性色素，廣泛分布于植物的果實中[7-8]。其安全性高，具有多種保健功能，以抗氧化作用最為顯著，被稱為“口服的皮膚化妝品”，可為機體補充營養并且及時清除體內自由基[9]。然而，截至目前，花青素功能活性研究仍處于起步階段，體內研究嚴重匱乏，限制了其在醫藥和保健食品中的應用。因此，本研究對黑果腺肋花楸進行水提取，并對其中花青素含量進行檢測，以黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）為體內研究對象，研究黑果腺肋花楸水提物對果蠅壽命、抗氧化相關指標以及氧化損傷下果蠅存活時間的影響，探討其體內抗氧化活性以及對自由基的清除作用，旨在為黑果腺肋花楸功能性開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑果腺肋花楸：由吉林省北佳中藥集團股份公司提供，經長春中醫藥大學生物工程實驗室白雪媛副研究員鑒定為薔薇科黑果腺肋屬黑果腺肋花楸；黑果腺肋花楸水提物：由長春中醫藥大學生物工程實驗室提供。

1.1.2 試劑

考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（P4907）、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒（96T）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（100 T/96樣）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（96 T）：南京建成生物工程研究所；百草枯（C10088960）：MACKLIN；30%過氧化氫（1601191）：西隴化工股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SZ660連續變倍體式顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司；m3x-430智能霉菌培養箱：浙江托普儀器有限公司；UV2550紫外分光光度計：日本島津公司；InfiniteM200PR0全自動酶標儀：TECAN。

1.3 動物

實驗所用Oregon K野生型黑腹果蠅由長春中醫藥大學生物工程研究室提供。收集8 h內羽化未交配雄性果蠅，培養溫度（25±1）℃，相對濕度50%～60%培養箱中培養。果蠅壽命實驗培養溫度（29±1）℃，相對濕度50%～60%。

1.4 方法

1.4.1 黑果腺肋花楸水提取指標性成分花青素含量測定

采用pH示差法測定黑果腺肋花楸水提物中花青素含量。吸取1.00mL黑果腺肋花楸水提物，實驗組1將其用pH=1.0的緩沖液稀釋100倍，實驗組2用pH=4.5的緩沖液稀釋100倍，混勻，放置70min，待反應至動態平衡。兩實驗組均以1.00mL 60%酸性乙醇提取液（乙醇含0.2%鹽酸的溶液[10-11]）加入等量緩沖液作空白對照。用紫外-可見分光光度計于510nm和710nm處測定吸光度值。根據花青素含量計算公式計算花青素含量，公式如下：

式中：A為吸光度值；Mt為矢車菊-3-葡萄糖苷相對分子質量449.2；DF為稀釋倍數；V為提取液總體積，mL；e為矢車菊素-3-葡萄糖苷消光系數29 600；b為比色光程長度1 cm；m為試樣質量，g。

1.4.2 果蠅培養基的制備

稱取玉米粉175 g，黃豆粉30 g及瓊脂粉20 g，加入3 L純凈水充分攪拌溶解。保持沸騰狀態30min后加入60 g安琪酵母粉，50 g蔗糖，50 g葡萄糖，充分混勻后繼續加熱煮沸。隨后量取90mL甘蔗糖漿加入容器中，冷卻20min，加入10%的尼泊金甲酯40mL及丙酸20mL制成普通培養基。在普通培養基的基礎上，分別加入不同體積的黑果腺肋花楸水提液，配成1、5、10mg/mL的含藥培養基。

1.4.3 果蠅壽命實驗

將培養于29℃培養箱中的2日齡果蠅隨機分成4組，對照組接入普通培養基中，給藥組接入含黑果腺肋花楸水提物培養基中（1、5、10mg/mL）。每組10管，每管20只。每2天記錄果蠅死亡數，每3天更換1次培養基，直至果蠅全部死亡。每組果蠅全部死亡天數平均數為該組平均壽命，每組果蠅半數死亡天數為該組半數死亡時間，每組最后死亡的20只果蠅存活天數的平均數為該組的最高壽命。

1.4.4 急性損傷模型果蠅存活實驗

1.4.4.1 百草枯急性試驗對果蠅存活時間的影響

果蠅分組情況同1.4.3。培養25 d后，將果蠅轉入空培養管中饑餓2 h，隨后將果蠅轉入事先放有蘸取1mL 6%的葡萄糖溶液配制成的20mmol/L的百草枯溶液濾紙條的培養管中，每隔4小時統計果蠅死亡只數，直至全部死亡。記錄每組果蠅的平均存活時間、半數存活時間以及最高存活時間。

1.4.4.2 雙氧水急性試驗對果蠅存活時間的影響

果蠅分組情況同1.4.3。培養25 d后，將果蠅轉入空培養管中饑餓2 h，隨后將果蠅轉入事先放有蘸取1mL 6%的葡萄糖溶液配制成的9%H2O2濾紙條的培養管中，每隔4小時統計果蠅死亡只數，直至全部死亡，記錄每組果蠅的平均存活時間、半數存活時間以及最高存活時間。

1.4.5 果蠅SOD、CAT活性及MDA含量測定

果蠅分組情況同1.4.3。培養25 d后，先將果蠅轉入空培養管中饑餓2 h，麻醉后稱重，按體積比1∶49比例加入生理鹽水，冰浴下勻漿，4℃2 500 r/min離心20min取上清用試劑盒測定CAT、SOD活性以及MDA含量。

1.4.6 數據處理

除黑果花楸中花青素含量測定數據以外，其余數據均以±s表示，組間比較行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 黑果腺肋花楸水提物指標性成分花青素含量測定

用紫外-可見分光光度計對實驗組及空白對照組溶液在510 nm和710 nm處測定其OD值，根據公式計算黑果腺肋花楸水提物中花青素含量，結果為（3.4±0.2）mg/g，與目前報道的其他含有高含量花青素的藍莓等相比結果相差無幾[12]，詳見表1。

表1 黑果腺肋花楸水提物中花青素的含量Table1 Contentsof anthocyanin in aqueousextractof Aroniamelanocarpa

2.2 對果蠅壽命的影響

與對照組相比，黑果腺肋花楸水提物高劑量組平均壽命延長率為11.24%，最高壽命延長率為3.95%，與對照組相比均存在顯著差異，詳見表2。

2.3 對百草枯急性試驗果蠅存活時間的影響

與對照組相比，黑果腺肋花楸水提物中、高劑量組平均存活時間約延長了2 h；最高存活時間分別延長了 0.3、3.0、3.2 h，延長率分別為 1.04%、10.45%、11.14%，其中、高劑量組變化顯著（p＜0.05），見表 3。

表2 黑果腺肋花楸水提物對果蠅壽命的影響（±s，n=200）Table2 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa on the Lifeof Drosophilamelanogaster（±s，n=200）

表2 黑果腺肋花楸水提物對果蠅壽命的影響（±s，n=200）Table2 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa on the Lifeof Drosophilamelanogaster（±s，n=200）

注：* 表示 p＜0.05，顯著；** 表示 p＜0.01，極顯著。

組別劑量/（mg/mL）平均壽命/d半數死亡時間/d 最高壽命/d對照 0 33.8±11.1 35.0 45.6±3.1水提物 1.0 34.8±11.9 38.0 46.5±3.0 5.0 37.0±12.9** 38.0 47.0±3.7 10.0 37.6±11.7** 41.0* 47.4±4.1*

表3 黑果腺肋花楸水提物對百草枯急性實驗果蠅存活時間的影響（x±s，n=200）Table3 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa on the Drosophilamelanogaster lifeof paraquatacuteexperimental（x±s，n=200）

2.4 對過氧化氫急性試驗果蠅存活時間的影響

與對照組相比，黑果腺肋花楸水提物中、高劑量組平均存活時間延長了約1 h。最長存活時間分別延長了3.6、4.8 h，延長率分別10.46%，13.95%，具有統計學意義（p＜0.05），見表 4。

表4 黑果腺肋花楸水提物對過氧化氫急性實驗果蠅存活時間的影響（±s，n=200）Table4 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa onthe Drosophilamelanogaster Lifeofhydrogen peroxideacute experimental（± s，n=200）

表4 黑果腺肋花楸水提物對過氧化氫急性實驗果蠅存活時間的影響（±s，n=200）Table4 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa onthe Drosophilamelanogaster Lifeofhydrogen peroxideacute experimental（± s，n=200）

注：* 表示 p＜0.05，顯著。

最高存活時間/h對照 0 21.8±6.3 22.0 29.0±3.2水提物 1.0 22.2±6.2 22.0 30.0±2.7 5.0 23.0±6.5* 23.0 31.3±3.1*10.0 23.3±6.4* 23.0 31.6±3.0*組別劑量/（mg/mL）平均存活時間/h半數存活時間/h

2.5 對相關果蠅抗氧化酶活力及MDA水平的影響

與對照組相比，黑果腺肋花楸水提物各劑量組均能提高CAT，SOD活性，降低MDA含量（p＜0.05或p＜0.01），且與藥物添加量呈現一定的劑量關系，詳見表5。

表5 黑果腺肋花楸水提物對果蠅抗氧化酶活力及MDA水平的影響（±s，n=3）Table5 Effectsof aqueousextractof Aroniamelanocarpa on antioxidantenzymeactivity and MDA levelof Drosophila melanogaster（±s，n=3）

表5 黑果腺肋花楸水提物對果蠅抗氧化酶活力及MDA水平的影響（±s，n=3）Table5 Effectsof aqueousextractof Aroniamelanocarpa on antioxidantenzymeactivity and MDA levelof Drosophila melanogaster（±s，n=3）

注：* 表示 p＜0.05，顯著；** 表示 p＜0.01，極顯著。

MDA/（U/mg pro）對照 0 234.58±18.67 68.54±5.12 1.04±0.37水提物 1.0 265.26±16.23* 71.25±5.75* 0.98±0.41組別 劑量/（mg/mL）SOD/（U/mg pro）CAT/（U/mg pro）5.0 367.12±16.17** 76.56±3.12** 0.93±0.32*10.0 394.34±14.12** 85.41±3.75** 0.64±0.38*

3 討論

壽命是衡量生命衰老規律的重要指標[13]。但大鼠等常用哺乳類模式生物存在生命周期較長、不易于重復等問題，限制了相關實驗的研究進展。近年來，果蠅已經成為模擬人類疾病很重要的模式生物，具有生命周期短、繁殖能力強、飼養簡單等優點，遺傳學分析顯示在哺乳動物和非脊椎動物中基本的細胞生物學信號通路（signaling transduction pathway）存在驚人的保守性[14]，這些特點使得它們可以成為理想且精良的模式生物。花青素是在水果和蔬菜中大量存在的天然黃酮類物質，其能保護人體免受自由基損傷。近年來，花青素對于抗氧化性、抗衰老性等有較多的研究報道，其藥理活性功能廣泛，安全性高，應用前景大。花青素的提取及理化性質研究已取得了很大的進步，但其生理功能活性及機制研究仍處于起步階段。因此，本研究首先對黑果腺肋花楸提取物中的花青素含量進行檢測，在此基礎上，以黑腹果蠅為研究對象，以雄性壽命作為評價指標，研究黑果腺肋花楸水提物的抗衰老活性。研究周期短，重現性好，數據可信度高。結果表明：黑果腺肋花楸水提物能顯著延長雄性果蠅的平均壽命和平均最高壽命，且具有一定的劑量效應。百草枯在細胞內形成的過量超氧化陰離子自由基和雙氧水產生的羥自由基可誘導果蠅產生氧化損傷。在本研究中，黑果腺肋花楸水提物能夠顯著提高果蠅耐受能力，延長存活時間，表明黑果腺肋花楸水提物對于清除超氧陰離子自由基和羥自由基具有一定的作用。SOD和CAT作為體內清除活性氧的主要抗氧化酶被認為是反應體內自由基清除能力的間接評價指標[15]。而MDA是自由基作用于不飽和脂肪酸而產生的脂質過氧化的產物，通常作為機體脂質過氧化程度的指標[16]。研究結果表明黑果腺肋花楸水提物能夠提高果蠅體內SOD及CAT酶活性，同時可降低MDA含量，且存在一定的劑量效應。綜上所述，黑果腺肋花楸水提物中花青素含量較高，且其抗衰老作用是通過提高體內相關抗氧化酶活性從而增強自由基清除能力而實現的。

參考文獻：

[1]Leslaw Juszczak,Mariusz Witczak,Dorota Galkowska.Flow Behaviourof Black Chokeberry(Aroniamelanocarpa)Juice[J].國際食品工程期刊,2009,5(1):161-167

[2]Dorota Walkowiak-Tomczak.Changes in antioxidant activity of black chokeberry juice concentrate solutions during storage[J].Acta Scientiarum Polonorum:Technologia Alimentaria,2007,6(2):49-56

[3]國石磊.黑果腺肋花楸花色苷分離純化、結構鑒定及其抗氧化活性研究[D].秦皇島:河北科技師范學院,2015

[4]于雪,胡文忠,姜愛麗,等.黑果腺肋花楸營養物質與功效的研究進展[J].食品工業科技,2016,34(10):396-400

[5]陳妍竹,胡文忠,姜愛麗,等.黑果腺肋花楸功能作用及食品加工研究進展[J].食品工業科技,2016,36(9):397-400

[6]國石磊,朱鳳妹,王娜,等.黑果腺肋花楸花色苷樹脂純化工藝及其穩定性研究[J].天然產物研究與開發,2015,33(9):1636-1642

[7]徐春明,龐高陽,李婷.花青素的生理活性研究進展[J].中國食品添加劑,2013(3):205-210

[8]侯銳,陳琦,王利,等.花青素及其生物活性的研究進展[J].現代生物醫學進展,2015,28(15):5590-5593

[9]Zhao JG,Yan QQ,Lu LZ,et al.In vivo antioxidant,hypoglycemic,and anti-tumor activities ofanthocyanin extracts from purple sweet potato[J].Nutr ResPract,2013,7(5):359-365

[10]王紹云,李性苑,潘永銀,等.響應面法優化透骨香果花青索超聲一振蕩提取工藝[J].中國食品添加劑,2017(4):127-133

[11]張榮菲,王紹云.貴州黔東南藍莓中花青素的提取與含量測定[J].中國食品添加劑,2016(11):190-194

[12]石桂珍,李京東,張玉清,等.藍莓花青素的提取及含量分析[J].食品研究與開發,2016,37(14):55-58

[13]杜麗娟,汪慶平,邵金良,等.響應面法對黑果構祀中花青素測定條件的優化[J].中國食物與營養,2016,22(6):50-54

[14]Calhoun AJ,Murthy M.Quantifying behavior to solve sensorimotor transformations:advances from worms and flies[J].Curr Opin Neurobiol,2017,30(46):90-98

[15]Moris D,Spartalis M,Tzatzaki E,et al.The role of reactive oxygen species inmyocardial redox signaling and regulation[J].Ann Transl Med,2017,5(16):324-332

[16]Zhou Q,Zhu L,ZhangD,etal.Oxidative Stress-Related Biomarkers in Postmenopausal Osteoporosis:A Systematic Reviewand Meta-Analyses[J].DiseaseMarkers,2016,2016(3):1-12