動物源性食品中性激素檢測方法的比較分析

周秋玲，婁婷婷，王素英，張宏宇，*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134；2.天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

動物源性食品包括可食用的動物組織及其高附加值的附屬產物，是日常膳食的重要組成部分。在規模效益和速度效率的催生下，獲得動物源性食品的自然周期被打破。激素可以有效降低成本，改善產品性狀。為了縮短飼養動物的生長和繁殖周期、提高飼料轉化率、改善動物源性食品性狀以及降低成本，多種人工激素在飼料中被無節制的使用，雖然動物源性食品產量大增，但是嚴重的激素殘留問題直接影響著人類的安全[1]。特別是目前使用最多的性激素，對人類健康危害極大，控制和禁止激素在養殖業中的使用及相關法律法規的建設已引起各方面的關注[2]。

近年來，食品安全事件屢見報端，性激素殘留的動物源性食品更使消費者談虎色變。所以，動物源性食品的安全已引起全社會的廣泛關注。從20世紀80年代開始，美國和日本等國家或組織就致力于通過立法禁止或限制在性激素類藥物在食用性動物飼養中的使用[3-8]。我國農業部176號公告明確規定，禁止飼料和動物飲用水中添加己烯雌酚、雌二醇等雌性激素，炔諾醇、左炔諾孕酮、炔諾酮等孕激素，并在235號公告規定了己烯雌酚、醋酸甲羥孕酮、甲基睪丸酮、群勃龍、玉米赤霉醇等外源性激素物質在動物性食品中的最高殘留限量為不得檢出[9-10]。盡管如此，由于商業利益驅動，這些禁藥依然不斷地通過動物源性食品進入體內，最終會對人類的健康產生不利的影響。因此，探討和開發動物源性食品中性激素的檢測方法，對于食品安全的綜合管理，有效保障食品安全具有重要的指導意義。

1 動物源性食品中性激素的來源

性激素是由動物性腺分泌或人工合成的一類甾體激素的總稱，分子量低，親脂性強，對動物體的生理及代謝起著重要的調節作用。性激素大都具有甾族化合物的母核結構，包括雌激素（雌二醇、雌三醇、雌酮）、孕激素（孕酮、甲羥孕酮、美侖孕酮）和雄激素（脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、二氫睪酮、甲睪酮、美雄酮、去甲雄三烯醇酮、去氫睪酮、去甲睪酮、脫氫表雄酮、雄烯二酮和表睪酮以及人工合成的酯化、甲氧基化或氟取代的衍生物）三大類[11-12]。根據來源和化學結構，性激素可分為人工合成類固醇激素（丙酸睪酮、甲烯雌醇、苯甲酸雌二醇、醋酸群勃龍等）、人工合成的非類固醇激素（己烯雌酚、己烷雌酚等）、內源性性激素（睪酮、孕酮、雌酮、17β-雌二醇）三大類[3]。

由于性激素在預防和治療家畜疾病方面具有顯著效果，且可以促進其生長、泌乳以及肌肉脂肪的分配，因此性激素會被用來育肥家畜，但是，通過口服或注射的性激素會殘留于動物體內而污染其制品[13-14]。

2 動物源性食品中性激素殘留的危害及相關檢測標準

性激素穩定性較高，正常的烹調加工均不能將其破壞，可通過食物鏈進入人體，在人體內積累的量超過人體正常水平時，就會破壞機體的正常生理平衡，從而產生一系列不良反應，其中以甲基睪酮、己烯雌酚和雌二醇較為典型。所以，大部分國家禁止性激素用于促進動物生長，不允許在食品中檢出，我國現行的動物源性食品中性激素的檢測標準見表1。

表1 我國現行的動物源性食品中性激素檢測方法的標準Table1 The standardsof detectionmethods for gonadalhormones in anim alderived food in China

甲基睪酮是由人工合成的性激素，由于其具有提

高產量和控制性別等作用，所以在動物養殖中被大量使用。但是，其在動物體內的代謝緩慢，即使極小的殘留會對人類健康造成巨大的潛在危害，包括美國、歐盟、日本等多個國家及組織已限制或禁止水產品中使用此激素并已立法[15]。我國農業部于2002年實施的行業標準NY5070-2002《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》中明確規定不允許使用甲基睪酮等激素類藥物，2003年農業部發布的235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規定其為禁止使用獸藥，在所有動物可食組織中不得檢出。

己烯雌酚具有促進蛋白合成，加快動物增重和骨骼鈣化的作用，可作為牛、羊的生長促進劑，減少飼料的使用量[16]。但是，己烯雌酚會殘留于動物源食品中，其不但會擾亂激素平衡，更嚴重的還會誘發女性乳腺癌、卵巢癌等疾病，農業部已明確規定禁止使用該性激素[17]。

雌二醇不但具有加速動物生長、繁殖的作用，而且可以提高畜禽瘦肉比例，在養殖業中得到廣泛應用[18]。但是雌二醇會在動物源食品中形成殘留，長期食用還會造成不育癥、女性早熟、男性女性化、男性生殖系統發育異常，使女性乳腺癌和子宮內膜異位癥發病率上升[19]。為此，早在1991年，美國已明確規定了雌二醇棕櫚酸在家禽的可食用部分的最高殘留限量為0.002mg/kg，而韓國規定牛肉中苯甲酸雌二醇最高限量是0.000 12mg/kg，歐盟早在1996年已立法并禁止該類性激素在食品動物養殖中使用，在我國，包括苯甲酸雌二醇等19種性激素及其鹽、酯等也禁止在食品動物養殖中使用[20]。

3 動物源性食品中性激素殘留的檢測研究進展

由于動物或動物源性食品基質具有一定的復雜性，性激素種類的多樣性以及低檢出水平的要求，而且樣品提取和凈化的過程比較復雜，導致回收率不高，使得性激素多殘留分析檢測具有一定的難度[21-23]。因此，如何對樣品進行預處理以富集、凈化待測組分并消除基體干擾，同時保證預處理過程中目標物性激素的損失最小，是一個必須解決的問題。另一方面要利用高靈敏度和高選擇性的檢測分析技術，盡量降低檢測限。

3.1 樣品的提取及凈化

動物源性食品中部分激素以水溶性較強的結合物形式存在。為了使其能溶于有機溶劑，需對樣品進行粉碎、冷凍干燥和均質化，通過酶解將結合態的性激素解離出來，然后用有機溶劑進行提取和富集[24]。為了獲得更加純凈的待分析物，動物組織中性激素的提取溶劑包括甲醇、乙腈、二乙醚、叔丁基甲醚、水-甲醇、水-丙酮、乙腈-偏磷酸、氯仿-甲醇等[25]。可采用液液萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取、冷凍離心除脂、加壓液體萃取等多種方法進行凈化處理，進一步方便目標性激素的檢測[26-29]。凈化的目的是去除生物基質中的脂肪、蛋白等雜質，從而降低干擾，提高分析靈敏度。為了達到更好的純化效果，也可將幾種方法或柱子結合使用。動物源性食品中幾種常見凈化方法優劣比較見表2。

3.2 動物源性食品中性激素的檢測和評價方法的比較

根據國內外對動物源性食品中獸藥殘留的規定，又因食品基質相對復雜，獸藥殘留量極低，因此對獸藥殘留的檢測方法、靈敏度等均有較高要求。分析檢測食品基質中性激素的傳統方法有紫外分光光度法、熒光光度法、酶聯免疫法（Enzyme linked immunosorbentassays，ELISA）、薄層色譜法、氣相色譜法（Gas chromatography，GC）、液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質譜聯用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質譜聯用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）、液相色譜-串聯質譜法（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）、氣相色譜-串聯質譜法（Gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）等，具體信息及其在應用中的優缺點見表3。

表3 動物源性食品中性激素檢測方法的比較Table3 Comparison of theadvantagesand disadvantagesof the detectionmethodsofanimalderived food

4 色譜-質譜法在動物源性食品性激素檢測中的研究進展

4.1 氣相色譜—質譜法

氣相色譜—質譜法包括氣相色譜—質譜聯用（GC-MS）和氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）。氣相色譜—質譜法集聚了色譜的高效分離及質譜在檢測和確認化合物的優點，氣相色譜—質譜法成為性激素檢測分析中常用的技術。氣相色譜—質譜法的靈敏度、準確度、回收率均較好，分析過程簡便快捷，適用于同時檢測性激素多組分殘留。但是，性激素對熱不穩定且不易揮發，用氣相色譜—質譜法分析，首先要用硅烷化試劑和酰基化試劑將性激素衍生化，獲得熱穩定性及揮發性都較好的衍生化物質。

黃冬梅等[30]將雌二醇D2作為內標定量，通過GCMS建立了水產品中雌二醇殘留量的檢測方法，采用葡糖苷酸酶酶解樣品，正己烷去除脂肪和色素等雜質，用乙酸乙酯提取，濃縮后衍生化，然后進行檢測。鄒龍等[31]以氘代同位素為內標，測定了不同魚貝類肌肉組織中雌二醇殘留量。首先在樣品中加入內標和乙酸鈉緩沖溶液并均質，然后用乙腈多次超聲提取，利用正己烷脫脂除雜質，利用C18固相萃取柱凈化和柱前三甲基硅烷化后，進行GC-MS分析。根據雌二醇和內標衍生物定量離子質量色譜圖的峰面積比值，內標標準曲線法定量，最低定量檢測限為2μg/kg。曾東平等[32]采用固相萃取小柱凈化衍生后，利用GC－MS對豬肌肉中甲睪酮等多種性激素殘留進行檢測，當濃度為2.5μg/kg～50μg/kg時，其線性關系較好，相關系數均大于0.97，回收率和靈敏度較好，可在水產品性激素殘留檢測中大力推廣。宮向紅等[33]用乙酸乙酯對鰻魚和蝦中性激素己烯雌酚進行提取，正相固相萃取小柱凈化、衍生后進行GC-MS分析，當添加水平在0.5μg/kg～1.0μg/kg時，回收率大于75%，相對標準偏差為0.9%～2.7%，線性相關系數為0.999。

湛嘉等[34-35]采用GC-MS分別對黃鱔和豬肉中的性激素殘留開展了檢測，采用葡糖苷酸酶對黃鱔提取物進行水解，用叔丁基甲醚提取，用正己烷脫脂，再經C18小柱和NH2小柱凈化，用七氟丁酸酐進行衍生化，基于外標法，利用GC-MS進行檢測，檢出限在0.50μg/kg～1.00μg/kg，平均回收率范圍為56%～103%，平均相對標準偏差范圍為3.1%～29.5%，且對不同批次樣品的重復性也較好；對豬肉中l6種性激素多殘留檢測結果顯示，檢出限在0.25μg/kg～1.0μg/kg之間，平均回收率分別為83.7%～107.9%，重復性好。

Scarth等[36]利用GC-MS/MS測雄性激素和孕激素，檢測限為 10.9 pg/mL～160.7 pg/mL。Rambaud 等[37]采用GC-MS/MS同時測定了動物毛發中的28種同化激素，用甲醇提取基質中的藥物，分別得到雌性激素與雄性激素和孕激素，檢測限為0.1μg/kg～10μg/kg。

但是，氣相色譜法要求分析物有較低的沸點和很好的揮發性，由于激素個體性質的差異常需要對其進行多種衍生處理，雖然氣相色譜分析法也能實現對物質的定性和確證分析，但需要衍生處理而太耗時，不能滿足快速分析的需要，有的激素也不容易通過衍生得到很好的極性和熱穩定性，制約了其在多殘留檢測中的應用。

4.2 液相色譜—質譜法

高效液相色譜法以液體作為流動相，可同時檢測多種類固醇激素，不受樣品揮發性和熱穩定性的限制，不需要衍生化，只要適當應用各種試劑及凈化方法，再結合一定的檢測器，可實現對多種物質的檢測分析。液相色譜-質譜法包括高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）、液相色譜－串聯質譜（HPLC-MS/MS）和超高效液相色譜－串聯質譜法（Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS），目前液相色譜－質譜法是分析食品中性激素多組分殘留的有效方法之一。

楊敏等[38]通過高效液相色譜法對魚、蝦中己烯雌酚殘留進行定量檢測，最低檢測限為2.5μg/kg，其回收率和線性關系良好。周建科等[39]采用高效液相色譜法成功建立了中老年奶粉中性激素的監測分析方法。Yang等[40]經Helix pomatia水解，甲醇提取，石墨化碳黑固相萃取，再過NH2柱，利用液相色譜方法檢測肉、奶、肝臟中50種激素殘留的含量。檢出限達到0.04 μg/kg～20 μg/kg。

但是，液相色譜的紫外檢測器存在一定的局限性，如果液相色譜結合三重四極桿、離子阱、飛行時間等質譜檢測器，可大大提高準確度，可實現多殘留的同時檢測分析。高效液相色譜-質譜法集高效分離和多組分定性定量于一體，可提供待測樣品完整的準分子、離子，如采用超高效液相色譜還可以進一步改善樣品的分離度、分析速度和靈敏度。

萬巧玲等[41]利用HPLC-MS/MS定量分析雌酮、17β-雌二醇和17α-乙炔基雌二醇，檢測限分別為0.5、0.4、0.1 ng/L。Vanhaecke 等[42]利用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測34種合成類固醇激素（包括10種雌性激素、14種雄性激素、10種促孕激素）在牛肉中的殘留，檢測限與定量限分別為0.04μg/kg～0.88μg/kg和0.12μg/kg～1.9μg/kg。該方法檢測到所有的自然的、合成的類固醇，實驗重現好，相對標準偏差＜20%，線性相關系數在0.991～0.999之間。Xu等[43]利用LC/ESIMS/MS檢測動物肌肉中10種激素殘留含量，檢出限達到 0.06μg/kg～0.22μg/kg，定量限達到 0.12μg/kg～0.54μg/kg。Blasco等[44]均質后經 SubtilisinA 降解，甲醇提取，過C18和NH2柱，乙腈洗脫，對肉制品中22中激素殘留進行了分析，檢出限小于0.5μg/kg。劉桂華等[45]開展了深圳市售豬肉、牛肉、雞蛋和牛奶中激素殘留情況的多組分同時測定，用乙腈提取待測樣品并用正己烷脫脂，然后利用HLB-NH2柱串聯固相萃取凈化，采用HPLC-MS/MS電噴霧電離，多反應監測模式檢測，內標法定量，20種目標性激素的方法定量限為0.5μg/kg～1.0μg/kg，方法平均回收率60.4%～118.2%，相對標準偏差2.5%～16.2%，該方法可用于豬肉、牛肉、雞蛋和牛奶中20種游離態性激素的檢測。

綜上所述，食品基質中性激素多殘留檢測的現行標準多采用液相色譜-質譜法，而且歸因于其較高的準確性和靈敏度，以液相色譜－質譜法來測定動物源性食品中性激素殘留的標準將不斷得到更新。

5 總結與展望

近幾年來，隨著科技的發展及生活水平的提高，食品中性激素多組分殘留的檢測要求越來越高，因此發展低檢出限高靈敏度的多組分殘留同時檢測方法越來越受到重視。目前，主要采用色譜與高靈敏度的檢測系統一質譜相結合來實現。但是在氣相色譜-質譜法使用過程中，很難做到一種衍生試劑可以將所有的性激素進行衍生，限制了多殘留的同時檢測；而且在衍生化過程中產生的副產物會對目標待測物產生干擾，使檢測的準確性和靈敏度降低。而采用液相色譜—質譜法適合分析熱穩定性和熱揮發性差的化合物，可避免上述問題，而且隨著多種質譜檢測器的應用，還可以確定一些未知激素進行定性和定量分析。

參考文獻：

[1]李寧,林小莉,董艷峰,等.飼料中非法添加激素類藥物檢測方法研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2016(8):166-168

[2]趙春娟,高文惠.飼料及畜產品中激素殘留檢測方法研究進展[J].飼料博覽,2015(1):9-14

[3]沈誠,徐昆龍,代佳和,等.甲基睪酮在動物源性食品中殘留危害及檢測方法的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫,2017(7):70-73

[4]王強,王旭峰,黃珂,等.酶聯免疫吸附法測定水產品中甲基睪酮殘留[J].現代食品科技,2015(5):303-308

[5]杜賽,高何剛,王若燕,等.動物源食品中雌激素檢測方法研究進展[J].中國衛生檢驗雜志,2016(12):1822-1824

[6]張學亮.色譜串聯三重四極桿質譜對禁限藥多殘留的檢測方法研究[D].北京:北京工業大學,2015:37-55

[7]尤亮亮,魏巍,劉海燕,等.固相萃取-高效液相色譜串聯質譜測定牛奶中9種性激素殘留[J].中國測試,2016,42(5):46-49

[8]高旭東,黃鑫,郝寶成,等.淺析動物源性食品中性激素殘留危害及其殘留檢測方法[C].中國畜牧獸醫學會獸醫藥理毒理學分會會員代表大會暨第十三次學術討論會與中國毒理學會獸醫毒理專業委員會第五次學術研討會,2015:167

[9]佚名.農業部、衛生部、國家藥品監督管理局聯合發布《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》(農業部公告第176號)[J].內蒙古畜牧科學,2002(3):46-47

[10]程堅.我國與CAC動物源性產品中藥物殘留限量的對比分析[J].安徽農業科學,2015(9):89-91,101

[11]TOKARZ J,M LLERG,ANGELISM H D,et al.Steroids in teleost fishes:A functionalpointofview[J].Steroids,2015,(103):123-144

[12]LITWACKG.Chapter 16-Steroid Hormones[M]//Human Biochemistry.Boston:Academic Press,2018:467-506

[13]李佩佩,郭遠明,張小軍,等.高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源食品中同化激素的研究進展[J].理化檢驗(化學分冊),2014(11):1476-1480

[14]張曉娜,楊鎰峰,常彤,等.雌激素、雄激素在卵泡發育中的作用及應用[J].特產研究,2017,39(3):50-54

[15]沈誠,徐昆龍,代佳和,等.甲基睪酮在動物源性食品中殘留危害及檢測方法的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫,2017(7):70-73

[16]隆雪明,匡光偉,陳福華,等.高效液相色譜法測定飼料中雌二醇、炔雌醇和己烯雌酚的含量[J].飼料研究,2017(2):27-29

[17]易鳴,朱志強,曾智.水產品中氯霉素和己烯雌酚快速檢測方法初探[J].漁業致富指南,2017(13):57-61

[18]原林.用于檢測雌二醇的酶熱傳感技術研究[D].北京:中國人民解放軍軍事醫學科學院,2015:9-12

[19]白宇,胡景炎,張井.食源性雌二醇殘留檢測技術研究進展[J].食品與發酵工業,2017,43(12):253-261

[20]劉建青.核糖體展示Anticalin模擬抗體庫的構建及其在雌二醇、百草枯模擬抗體篩選中的應用[D].天津:天津大學,2012:8-12

[21]盧杰.亞臨界R134a萃取技術在水產品性激素多殘留分析中的應用研究[D].青島:中國海洋大學,2014:3-25

[22]M RTA Z,BOB LY B,FEKETE J,etal.Simultaneous determination of thirteen different steroid hormones usingmicro UHPLC-MS/MS withon-line SPEsystem[J].JournalofPharmaceuticaland BiomedicalAnalysis,2018,150:258-267

[23]TAN X-T,LIZ-M,DENG L-G,et al.Analysis of 13 kinds of steroid hormones in raw milk using modified QuEChERSmethod combined with UPLC-QTOF-MS[J].Journal of Integrative Agriculture,2016,15(9):2163-2174

[24]胡雪玲,李瑩.動物源性食品中殘留前處理技術及檢測方法研究進展[J].現代食品,2017(12):13-15

[25]趙子佳,張宇,孫佳明,等.動物源性食品中殘留前處理技術及檢測方法研究進展[J].吉林中醫藥,2017,37(1):55-57

[26]藍航鎮.新型固相微萃取涂層的研制及其應用于食品中雌激素殘留的分析研究[D].寧波:寧波大學,2015:3-80

[27]曹江平,邸宏偉,周繼梅,等.分散液液微萃取技術的研究進展[J].分析測試學報,2016,35(7):913-921

[28]趙超敏,岳振峰,吳暉,等.液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中4種雌激素殘留[J].現代食品科技,2014,30(6):244-249

[29]項瑋.PLE萃取-GPC凈化-LC-MS/MS法測定沉積物中8種性激素[J].現代化工,2017,37(9):206-210

[30]黃冬梅,錢蓓蕾,惠蕓華.GC-MS測定水產品中雌二醇殘留量[J].分析試驗室,2008,27(s2):153-156

[31]鄒龍,林洪,江潔.氘代同位素內標氣相色譜-質譜法測定魚貝類肌肉中β-雌二醇殘留[J].分析化學,2007,35(7):983-987

[32]曾東平,林翠萍,曾振靈,等.氣相色譜-質譜法檢測豬肌肉中8種性激素的殘留[J].中國農業科學,2008(9):2776-2782

[33]徐英江,張秀珍,宮向紅,等.使用液相色譜熒光法測定水產品中己烯雌酚殘留量的方法.101718755B[P].2013-06-12

[34]湛嘉,俞雪鈞,李佐卿,等.黃鱔肌肉中11種性激素的氣質聯用檢測方法[J].分析測試學報,2007,26(5):642-646

[35]湛嘉,李佐卿,俞雪鈞,等.豬肉中16種性激素的多殘留檢測方法[J].寧波大學學報(理工版),2007,20(4):520-525

[36]SCARTH J,CLARKEA,HANDSJ,etal.Validation of a quantitativemulti-residue urinary assay for the detection of androgen,oestrogen and progestagen abuse in the bovine[J].Chromatographia,2010,71(3/4):241-252

[37]DUFFY E,RAMBAUD L,LE B B,etal.Determination of hormonal growth promoters in bovinehair:comparison of liquid chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry methods for estradiol benzoate and nortestosterone decanoate[J].Analytica Chimica Acta,2009,637(1/2):165-172

[38]楊敏,仲娜.魚、蝦中己烯雌酚殘留的高效液相色譜法測定研究[J].中國衛生檢驗雜志,2011(8):1878-1879

[39]周建科,張前莉,韓康,等.中老年奶粉中雙酚A和己烯雌酚的反相高效液相色譜測定[J].食品工業科技,2007(2):233-234

[40]YIY,BINGS,JINGZ,etal.Determination of the residuesof50 anabolic hormones in muscle,milk and liver by very-high-pressure liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].JournalofChromatography B,2009,877(5/6):489-496

[41]萬巧玲,陽春,張智,等.響應曲面法在類固醇雌激素HPLCMS-MS定量分析中的應用[J].重慶大學學報 (自然科學版),2011,34(5):105-111

[42]SCARTH JP,KAY J,TEALEP,etal.A review ofanalytical strategies for the detection of'endogenous'steroid abuse in food production[J].Drug Testing&Analysis,2012,4(S1):40-49

[43]XUC L,CHU XG,PENGCF,etal.Developmentofa faster determination of 10 anabolic steroids residues in animalmuscle tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical&BiomedicalAnalysis,2006,41(2):616-621

[44]BLASCOC,VAN PC,VAN PC.Analysis ofmeat samples for anabolic steroids residues by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].JournalofChromatography A,2007,1154(1/2):230

[45]劉桂華,秦偉,劉紅河,等.LC-MS/MS同時測定動物源性食品中20種游離態性激素殘留[J].衛生研究,2013,42(1):66-71