肝細胞癌側群/非側群細胞中miRNA-21表達差異的檢測△

呂洋，楊珮珮，葉龍，趙平，姜經航

荊門市第二人民醫院普外科，湖北 荊門 448000

目前腫瘤切除手術仍然是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）最主要的治療方案之一，但術后復發率高，導致患者的生存率低，預后差。腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）與腫瘤的發生和發展密切相關，可以增強腫瘤細胞對放化療的敏感性，促進腫瘤的復發和轉移，因此針對CSC進行的靶向治療可能為腫瘤治療的新方向。近年來，有研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）通過調控腫瘤細胞的增殖、遷移和凋亡可影響HCC的復發、轉移和預后[1]。有報道指出，miRNA-21可以促進腫瘤細胞增殖和凋亡，并且與多種腫瘤有關，miRNA-21表達上調的患者術后無瘤生存時間縮短，預后差[2]。本研究通過檢測MHCC-97H細胞中側群（side population，SP）細胞和非側群（nonside population，NSP）細胞的miRNA-21含量，分析其與CSC的關系，為進一步探討miRNA-21表達與HCC干細胞的關系提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝細胞癌的MHCC-97H細胞系購自復旦大學肝病研究所。Hoechst33342、維拉帕米（verapamil）和7-AAD購自Sigma公司（美國），高糖DMEM培養液和胎牛血清購自Gibco公司（美國），FACSC Salibur流式細胞儀購自BD公司（美國），Trizol試劑購自Invitrogen公司（美國），SYBR?Premix和逆轉錄試劑盒購自Takara公司（日本），熒光定量PCR儀ABI7300購自ABI公司（美國）。

1.2 檢測方法

1.2.1 細胞培養 將HCC的MHCC-97H細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 SP細胞檢測與分選 將處于對數期的腫瘤細胞消化、計數后調整細胞密度為1×106/ml，分為實驗組和對照組。對照組：加入Hoechst33342染料前15 min，細胞懸液中加入verapamil，調整verapamil濃度為50μmol/L。然后實驗組和對照組細胞懸液中均加入Hoechst33342染料，并且將Hoechst33342染料濃度調整為5、6、7、8、9、10、11、12 mg/L。將實驗組和對照組細胞同時置于37℃恒溫水浴箱中孵育90 min，為防止細胞在孵育過程中出現沉降現象，每10 min將裝有細胞的試管混勻1次。90 min后用4℃預冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌細胞。將洗滌后細胞用含有5%胎牛血清的高糖DMEM培養液重懸，然后加入7-AAD，調節其濃度為1 mg/L。進行流式細胞儀器檢驗前需將細胞過濾于上樣管中，保存于冰上。具體流程可以參照文獻[3]。重復3次。

1.2.3 總RNA的提取 選SP、NSP細胞，離心后收集，Trizol法提取總RNA，總RNA的純度用核酸微量檢測儀進行分析檢測，總RNA的完整性使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。

1.2.4 逆轉錄去除基因組DNA 參照Taraka試劑說明書提供的逆轉錄、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）反應體系和條件進行相應的實驗。所得cDNA分裝并保存于-20℃冰箱中用于后續實驗。

1.2.5 RT-PCR 使用Takara公司提供的引物序列，詳見表1。以hsa-U6為內參。基因的表達量通過2-△△Ct法確定，△△Ct=（CtSP細胞miRNA-21－CtSP細胞hsa-U6）－（CtNSP細胞miRNA-21－CtNSP細胞hsa-U6）。每個樣本均設3個復孔。

表1 引物序列

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SP、NSP細胞的識別

經7-AAD染色后去除死細胞和細胞碎片，前向角散射（forward scatter，FSC）信號見圖1。通過Hoechst33342紅光和藍光雙參數圖可以區分SP細胞與NSP細胞，SP細胞具有外排Hoechst33342染料的作用，因此表現為弱染狀態，左下角具有2種熒光——預熱355 nm波長紫外光，激發Hoechst33342染料，經610 nm雙色短通反射濾鏡分為兩類散射熒光，包括450/30帶通下的藍光部分（Hoechst blue）以及675/20帶通下的紅光部分（Hoechst red）——均為陰性或很弱的區域。以Hoechst blue為Y軸，Hoechst red為X軸作二維散點圖，并設定低Hoechst red及低Hoechst blue且維拉帕米組缺失的區域為SP細胞的“門”，檢測并分選SP、NSP細胞，詳見圖2。

圖1 7-AAD標記活細胞（P0）

圖2 流式細胞儀分選SP、NSP細胞

2.2 SP細胞的監測與分選

采用不同濃度的Hoechst33342對HCC的MHCC-97H細胞進行染色后，隨著染料濃度的增加，檢測發現活細胞的數量出現減少趨勢，說明染料Hoechst33342可以對活細胞產生一定的毒性，并且隨著濃度的增加，毒性亦增加。隨之SP細胞數量也減少，但是對照組中仍有SP細胞存在，細胞并未完全染色。對照組SP細胞數量為0時，染色的活細胞比例較高，對應的染料濃度為10 mg/L，此時實驗組SP細胞的平均比例為（8.4±0.7）%。（表2）

2.3 總RNA的純度與完整性

從SP、NSP細胞中提取的總RNA純度為1.8～2.0，其中沒有DNA和蛋白質混雜。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示3條條帶清晰，并且每種細胞的總RNA無拖尾條帶。（圖3）

表2 HCC的MHCC-97H細胞中活細胞與SP細胞的比例（%，±s）

表2 HCC的MHCC-97H細胞中活細胞與SP細胞的比例（%，±s）

Hoechst33342染料濃度（mg/L）5 6 7 8 9 1 0對照組6.8±1.8 1.9±1.1 0.7±0.3 0.4±0.1 0.2±0.1 11 12活細胞實驗組98.6±0.9 97.8±1.1 96.4±0.9 94.7±1.3 93.5±0.5 92.4±1.7 88.4±3.4 86.5±2.7對照組97.7±0.2 96.8±0.4 95.3±1.2 92.6±0.8 90.4±2.2 88.1±2.0 79.1±2.5 76.6±4.3 SP細胞實驗組44.8±5.7 32.4±4.2 23.3±4.8 12.0±1.9 10.3±2.1 8.4±0.7 6.3±1.4 3.2±0.9 0 0 0

2.4 SP與NSP細胞中miRNA-21的表達情況

以hsa-U6為內參，采用RT-PCR法檢測SP細胞中miRNA-21的含量是NSP細胞的（7.30±0.78）倍，差異有統計學意義（P﹤0.05）。

3 討論

有研究發現，CSC歸巢是腫瘤轉移的本質，而干細胞龕是干細胞集中存儲的地方，具有特定的微環境，嚴格調節和控制干細胞的正常活動[4]。腫瘤細胞轉移時，CSC從原發腫瘤病灶脫離，進入周圍血管的血液或者淋巴循環。CSC通過感受趨化因子的濃度梯度，黏附于血管內皮細胞表面，而后穿過微血管管壁，在趨化因子的作用下CSC在轉移位點尋找干細胞龕，形成腫瘤轉移病灶，完成CSC歸巢[5]。因此針對歸巢的CSC處理的研究有可能為腫瘤的靶向治療提供依據，可能提高患者的遠期生存率。但CSC缺乏特異性標志物，對其分離、純化比較困難，因此建立簡便且有效的分離方法是研究CSC的首要目標。

自SP細胞從小鼠骨髓造血干細胞中首次被發現以來[6]，越來越多的學者從多種惡性腫瘤細胞中分離出具有一定繼續多向分化、無限增殖和自我更新的具有干細胞特性的SP細胞[3,7-8]，表明SP細胞中包含部分CSC。因此，通過SP細胞分選方法富集CSC被認為是一種簡便且有效的途徑。

ATP結合盒轉運體可以將針對細胞核DNA的Hoechst33342染料排除細胞外，在流式細胞系上位于流式標記的雙參數圖左下角，主要表現為細胞核不染色或染色程度很低；同時其外排能力可以被verapamil抑制，SP細胞比例明顯減少，甚至消失。本研究中對照組細胞加入verapamil后，在控制所研究的細胞具有相對活性細胞的前提下，隨著Hoechst33342染料濃度的增加，verapamil阻斷的細胞中SP標記陽性細胞逐漸減少，將對照組SP標記陽性細胞比例為0時實驗組存在的且具有活性的細胞定義為SP細胞。本研究通過流式細胞儀分選出的SP細胞已經被相關研究證實具有HCC干細胞相關特性[9]。

圖3 總RNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果

有研究表明，miRNA在調控CSC的自我更新和多向分化中發揮著重要的作用，類似癌基因和抑癌基因的作用[10]。因此推測將miRNA作為研究CSC的方向，可能為臨床腫瘤治療提供新的治療方案。miRNA-21已經證實與多種惡性腫瘤存在一定的關系，miRNA-21高表達可以促進肝癌、胃癌和乳腺癌等腫瘤細胞的增殖、轉移[2]。有研究表明，在胰腺癌中miRNA-21可以啟動CSC，促進CSC轉移，增強腫瘤化療抵抗[11]。

最近有研究發現，多種CSC中miRNA-21表達上調，對CSC的生物學特性有一定的影響[12]。Misawa等[12]從多種腫瘤細胞系中分離出具有CSC特性的SP細胞，基因芯片檢測結果顯示，SP細胞的miRNA-21表達水平高于NSP細胞，同時SP細胞的克隆形成能力受到抑制及對化療藥物敏感性增強均與miRNA-21表達下調有密切的關系。另外，有研究發現結腸癌干細胞miRNA-21表達上調，并通過抑制PDCD4表達增強干細胞接種于裸鼠后的成瘤能力[13]。同時，miRNA-21過表達可以增加干細胞的生物學特性，促進乳腺癌MCF-7細胞發生上皮-間葉樣表型轉化，導致腫瘤進一步發展，侵襲、遷移和克隆形成能力明顯增強[14]。國內學者Li等[15]通過分析miRNA基因表達譜發現大鼠HCC干細胞中miRNA-21表達也出現上調的情況。本研究中SP細胞的miRNA-21表達水平是NSP細胞的（7.30±0.78）倍，差異有統計學意義（P﹤0.05），可以間接說明miRNA-21表達與HCC干細胞存在某種關系，檢測患者HCC組織中干細胞和非干細胞中miRNA-21的表達水平，可以評估患者的腫瘤惡性程度和復發風險，同時對于miRNA-21表達水平高的患者，術后應該密切監測，采取相應的治療方案，預防腫瘤復發，提高患者的生存率。

綜上所述，本研究采用優化Hoechst33342染料濃度的前提下，通過流式細胞儀將SP、NSP細胞從HCC細胞系MHCC-97H中分離，經RT-PCR檢測發現SP細胞的miRNA-21表達水平高于NSP細胞，說明miRNA-21表達與HCC干細胞存在一定的關系，但其相應的分子學機制需要后續實驗進一步探討。

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