上調miRNA-335表達對肺癌細胞增殖、凋亡及對survivin表達的影響

高立偉，蘭守麗，閆江濤，左一凡，武素芳，張暉

平煤神馬醫療集團總醫院腫瘤二區（胸部腫瘤科），河南 平頂山 467000

肺癌是常見的呼吸系統惡性腫瘤，近年來，其發病率呈逐年上升的趨勢[1-2]。肺癌的發生及發展是一個多基因、多階段的過程，因此，研究肺癌的發病原因及發病機制具有重要的意義。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是在生物體內發現的由19～25個核苷酸組成的一類小分子RNA，近些年來在腫瘤中的作用已受到廣泛關注，已有多項研究顯示，miRNA與肺癌的發生發展、預后及診斷治療關系密切，如低表達的miRNA-21可以抑制肺癌細胞的增殖及分化，并促進細胞的凋亡[3-4]；外周血中miRNA-143的含量可用于非小細胞肺癌的早期診斷及預后判斷[5]。miRNA-335定位于人染色體7q32.2，研究顯示，miRNA-335在乳腺癌、肺癌中呈現低表達，其高表達可降低腫瘤細胞的轉移及侵襲能力[6]。而miRNA-335在結腸癌中呈現高表達，可促進腫瘤細胞的轉移及侵襲，說明miRNA-335在不同腫瘤組織中發揮著不同的作用[7]。為了研究miRNA-335在肺癌中的作用，筆者利用miRNA-335的模擬物mimics轉染A549細胞，觀察細胞的增殖及凋亡情況，并進一步研究其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌A549細胞購自鄭州大學實驗室。胎牛血清、RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；RNA提取試劑盒、LipofectamineTM2000試劑均購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自日本Takara公司；survivin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國Abcam公司；酶標儀、流式細胞儀均購自美國Bio-Rad公司；PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司。

1.2 細胞培養及轉染

人肺癌A549細胞在37℃、5%CO2、95%飽和濕度的恒溫孵育箱中用含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養基傳代培養。每2～3天換液1次，細胞生長至80%融合時進行轉染。轉染分為3組，即對照組（不作任何處理）、空轉染組（轉染空載體）、過表達組（轉染miRNA-335 mimics）。轉染嚴格按照LipofectamineTM2000轉染說明進行操作。

1.3 RT-PCR檢測轉染效果

采用反轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測轉染效果。取轉染48 h的上述3組細胞，采用Trizol法提取細胞中的總RNA，逆轉錄試劑盒反轉錄總RNA為cDNA。參照GenBank中的基因序列，利用Primer premier 6.0引物設計軟件設計目的基因miRNA-335及內參基因U6的RTPCR引物，以cDNA為模板，應用實時熒光定量PCR擴增儀進行擴增。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。應用2-△△Ct法計算miRNA-335的mRNA相對表達量。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

人肺癌A549細胞以1×104/ml的濃度接種至96孔細胞培養板中，每孔加入100 μl，每孔設置3個復孔，培養箱中培養24 h后進行同步化處理，根據上述分組進行轉染，取轉染48 h的細胞，在每孔細胞中加入10 μl的CCK8溶液，培養箱內孵育2 h，利用全自動酶標儀檢測570 nm波長的吸光度（absorbance，A）。計算細胞存活率。細胞存活率=（轉染組細胞A值/對照組細胞A值）×100%。其中，每組實驗重復3次。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

細胞分組同1.2，取轉染48 h的細胞，加入預冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌細胞，胰蛋白酶消化細胞，調整細胞濃度為1×106/ml，根據細胞凋亡試劑盒的操作說明檢測各組細胞的凋亡情況。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測survivin蛋白表達

收集轉染48 h的上述3組細胞，加入適量的細胞裂解液提取細胞中的蛋白，使用BCA試劑盒檢測提取蛋白的濃度，蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶5的比例充分混勻后置于100℃孵育器內煮沸變性10 min，每泳道30 μg蛋白樣品，10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，半干法聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉染，5%的脫脂奶粉封閉，加入一抗（survivin抗體按照1∶500稀釋，GAPDH抗體按照1∶1000稀釋），4℃過夜，洗膜后加入1∶5000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，洗膜后增強化學發光法（enhanced chemiluminecence，ECL）顯色，X線片曝光，顯影，定影。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人肺癌A549細胞中miRNA-335的mRNA表達

對照組、空轉染組及過表達組miRNA-335的mRNA 相對表達量分別為（1.00±0.18）、（1.09±0.16）、（7.79±0.59），3組比較，差異有統計學意義（F=335.501，P﹤0.05）。其中，空轉染組與對照組miRNA-335的mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）；過表達組miRNA-335的mRNA表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P﹤0.05）。（圖1）

圖1 3組細胞中miRNA-335的mRNA相對表達量

2.2 過表達miRNA-335對A549細胞增殖的影響

對照組、空轉染組和過表達組的細胞存活率分別為（100.00±2.36）%、（96.56±3.46）%、（65.54±5.35）%，3組比較，差異有統計學意義（F=70.236，P﹤0.05）。其中，空轉染組與對照組的細胞存活率比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），而過表達組的細胞存活率低于對照組，差異有統計學意義（P﹤0.05）。（圖2）

圖2 過表達miRNA-335對A549細胞增殖的影響

2.3 過表達miRNA-335對A549細胞凋亡的影響

對照組、空轉染組和過表達組的細胞凋亡率分別為（1.74±0.55）%、（1.78±0.58）%、（14.32±1.21）%，3組比較，差異有統計學意義（F=225.043，P﹤0.05）。其中，空轉染組與對照組的細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），而過表達組的細胞凋亡率高于對照組，差異有統計學意義（P﹤0.05）。（圖3）

圖3 過表達miRNA-335對A549細胞凋亡的影響

2.4 miRNA-335過表達對survivin蛋白表達的影響

采用Western blot檢測凋亡相關蛋白survivin的表達水平，結果顯示，對照組、空轉染組和過表達組survivin的蛋白表達量分別為（0.554±0.047）、（0.566±0.046）、（0.102±0.016），3組比較，差異有統計學意義（F=137.441，P﹤0.05）。空轉染組與對照組的survivin蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），而過表達組survivin的蛋白表達低于對照組，差異有統計學意義（P﹤0.05）。（圖4）

3 討論

圖4 miRNA-335過表達對survivin蛋白表達水平的影響

目前，腫瘤的生物治療成為腫瘤治療的新思路，特別是利用基因治療腫瘤。近些年，miRNA作為重要的生物體基因調控分子，其與腫瘤的關系已成為生物領域研究的熱點。miRNA在結構及序列上進化保守，廣泛存在于生物體內，可在轉錄后對一個或多個基因的表達進行調控，參與細胞的增殖、凋亡、分化及個體的生長發育等生命過程[8]。在多種腫瘤中，miRNA發揮抑癌基因或癌基因的作用，與腫瘤的發生發展、轉移、復發等關系密切，如miRNA-378可參與非小細胞肺癌的腦轉移，促進細胞的侵襲、遷移，進而促進腫瘤血管的形成[9]；miRNA-340在侵襲能力強的乳腺癌細胞中表達下調，誘導其表達可抑制腫瘤細胞的轉移及侵襲[10]。

miRNA-335作為miRNA家族中的一員，近些年的研究發現，在不同腫瘤中，miRNA-335發揮不同的作用。研究顯示，卵巢癌細胞中miRNA-335的表達水平降低或缺失，其表達與耐藥呈負相關[11]；miRNA-335在胃癌細胞中可以通過靶向調控SP1的表達從而抑制腫瘤細胞的轉移及侵襲[12]，而在星形膠質瘤細胞中miRNA-335呈高表達狀態，其表達可增強腫瘤細胞的增殖及侵襲能力[13]。因此，miRNA-335在肺癌中的作用尚需進一步的研究。

有研究顯示，miRNA-335在肺癌細胞中低表達[14]，本研究結果顯示，過表達miRNA-335后，肺癌細胞的增殖受到抑制，凋亡數量增加。細胞凋亡在腫瘤的發生、發展過程中發揮著重要的調控作用，其過程受到抗凋亡基因和促凋亡基因的共同調控。survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中的一員，也是最強的凋亡抑制因子，可通過抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）的活性阻斷凋亡的發生，從而在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要的作用[15]。研究顯示，survivin在肺癌、胃癌等多種腫瘤細胞中呈現高表達，在肺癌細胞中抑制其表達可誘導腫瘤細胞的凋亡[16-17]。本研究中，過表達miRNA-335后檢測肺癌細胞survivin的蛋白表達水平，結果顯示，survivin蛋白的表達水平降低，說明過表達miRNA-335可以通過下調survivin誘導肺癌細胞的凋亡。

綜上所述，上調肺癌細胞miRNA-335表達可以抑制腫瘤細胞的增殖，并通過下調survivin蛋白的表達誘導細胞凋亡。本研究從分子水平上為肺癌的發病原因尋找到了理想的標志物，也為肺癌的診斷與治療提供了線索。

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