miRNA-214在甲狀腺乳頭狀癌患者血清中的表達水平及臨床意義

郭輝，張斌，胡利民

天門市第一人民醫院普外科，湖北 天門 431700

甲狀腺癌是一種常見的內分泌系統惡性腫瘤， 發病率居所有惡性腫瘤的第6位[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的一種組織學類型，PTC屬于高分化惰性腫瘤，大多數預后良好，但仍有部分患者出現淋巴結轉移或被膜侵犯，影響手術切除率及患者預后。因此，開展PTC相關分子生物學研究，尋找可評估PTC侵襲性、指導術式及評價預后的分子標志物至關重要。研究顯示，除基因重排與突變外，微小RNA（miRNA）也參與PTC的發生和發展[2]。miRNA是一種高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，參與細胞增殖、分化及凋亡等過程[3]。由miRNA介導的基因轉錄后調控是一種重要的基因表達調控方式，miRNA突變或異常在腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移過程中發揮關鍵作用[4]，且與腫瘤的治療反應、分期、預后及復發檢測密切相關[5]。miRNA-214作為miRNA家族成員之一，具有類似癌基因或抑癌基因的功能。研究證實，miRNA-214表達異常與乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡過程密切相關，可作為腫瘤診斷、治療及預后評估的分子標志物[6]。外周血miRNA具有良好的穩定性，miRNA檢測具有靈敏、便捷等優勢，成為近年來腫瘤分子生物學的研究熱點[7]。本研究采用實時熒光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術檢測PTC及良性甲狀腺腫瘤患者的血清miRNA-214表達水平，分析其與PTC患者臨床特征的關系，旨在探討其在PTC診斷及個體化評估中的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年1月至2017年6月天門市第一人民醫院收治的經術后病理檢查確診的50例PTC患者和46例良性甲狀腺腫瘤患者的臨床資料。所有患者均排除其他惡性腫瘤史，術前均未接受抗腫瘤治療。PTC患者中，男20例，女30例；年齡24～63歲，平均（43±12）歲；甲狀腺腫瘤患者中，男14例，女32例；年齡25～71歲，平均（45±14）歲；結節性甲狀腺腫31例，甲狀腺腺瘤15例。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血清采集與保存 采集患者的清晨空腹外周靜脈血4 ml，置于真空血樣采集管中，室溫靜置30～60 min，3500 r/min離心 10 min，收集上層血清于無酶EP管中，保存于-80℃醫用低溫箱。

1.2.2 血清總RNA提取 采用QIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit抽提和純化標本中的總RNA，具體操作嚴格按照說明書進行。采用分光光度計檢測提取的總RNA純度及濃度，取A260/A280為1.8～2.1的樣本，置于-80℃醫用低溫箱保存用于后續試驗。

1.2.3 逆轉錄 采用QIAGEN公司的miScriptⅡRT Kit將RNA逆轉錄成cDNA，反應體系（20 μl）：5×miScript HisSpec Buffer 4 μl，10×miScript Nucleics Mix 2 μl，RNase-free water 6 μl，miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μl，RNA 6 μl。反應條件：37℃、60 min，95℃、5 min。將逆轉錄反應液用RNase-free water稀釋11倍后進行分裝，置于-20℃保存備用。

1.2.4 PCR擴增 采用QIAGEN公司的miScript SYBR? Green PCR Kit和miScript Primer Assays對cDNA模板進行PCR擴增。miRNA-214及內參Ce_miR-39_1的特異性引物均為QIAGEN公司專利產品（Assay name:Hs_miR-214_2）。反應體系（20 μl）：2 × QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，10×miScript Precursor Assay 2 μl，RNasefree water 6 μl，模板 cDNA 2 μl。反應條件：95 ℃、15 min（預變性），94℃、15 （s變性），55℃、30 （s退火），共40個循環；70℃、30 （s延伸）。每個樣本設置兩個復孔，每批樣本設置1個空白對照。

1.2.5 miRNA-214相對表達量的計算 采用2-△△Ct法計算miRNA-214的相對表達量，以Ce_miR-39_1為內參。每個標本的Ct值取復孔均值，△Ct=C（tmiRNA-214）－C（tCe_miR-39_1），△△Ct=△Ct試驗組－△Ct對照組，miRNA-214的相對表達量為2-△△Ct。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0和Medcalc 15.2.2軟件對-數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）或中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Mann-Whitney U檢驗分析miRNA-214表達水平與PTC患者臨床特征的關系。繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線），分析miRNA-214對PTC的診斷效能。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC患者和良性甲狀腺腫瘤患者血清miRNA-214表達水平的比較

PTC患者的血清miRNA-214表達水平為3.798（1.856，5.094），明顯高于良性甲狀腺腫瘤患者的 1.272（0.711，2.351），差異有統計學意義（Z=-2.941，P=0.003）。

2.2 血清miRNA-214表達水平與PTC患者臨床特征的關系

血清miRNA-214表達水平與PTC患者的腫瘤最大徑、被膜侵犯情況、淋巴結轉移情況及TNM分期有關（P﹤0.05），與患者的性別、年齡無關（P﹥0.05）。（表1）

表1 血清miRNA-214表達水平與PTC患者臨床特征的關系

2.3 血清miRNA-214對PTC的診斷價值

以術后病理結果為金標準繪制ROC曲線，血清miRNA-214診斷PTC的曲線下面積（area under curve，AUC）為 0.762（Z=5.328，P﹤0.01，95%CI：0.664～0.843）。當Youden指數為0.478時，cut off值為3.778，靈敏度為50.00%，特異度為97.83%。（圖1）

圖1 血清miRNA-214診斷PTC的ROC曲線

2.4 血清miRNA-214對PTC侵襲、轉移的診斷價值

以術后病理結果為金標準繪制ROC曲線，血清miRNA-214診斷PTC淋巴結轉移的AUC為0.825（Z=4.228，P﹤0.01，95%CI：0.692～0.918），當Youden指數為0.639時，cut off值為4.865，靈敏度為81.82%，特異度為82.05%。血清miRNA-214診斷 PTC 被膜侵犯的 AUC 為 0.757（Z=3.649，P﹤0.01，95%CI：0.615～0.867），當Youden指數為0.427時，cut off值為4.103，靈敏度為75.00%，特異度為67.65%。（圖 2、圖 3）

3 討論

圖2 血清miRNA-214診斷PTC淋巴結轉移的ROC曲線

圖3 血清miRNA-214診斷PTC被膜侵犯的ROC曲線

miRNA是廣泛存在于動植物體內，長約22個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA，能以堿基互補的形式特異性結合mRNA，抑制靶mRNA的轉錄和翻譯，或直接降解靶mRNA，在轉錄后水平對基因表達進行負性調控，從而參與細胞的增殖、分化及凋亡。miRNA-214是miRNA家族的重要成員，位于染色體1q24.3區域和發動蛋白超家族成員DNM3第14號內含子上。miRNA-214為多功能miRNA，研究表明，miRNA-214在不同腫瘤中的表達水平不同，可通過調控癌基因及抑癌基因的表達水平，從而在腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移過程中發揮重要作用[8]。外周血miRNA為最小的非侵入性分子標志物，組織中的miRNA可經主動分泌或被動滲漏等途徑進入外周血。外周血miRNA具有良好的抗RNase活性[9]，且受內源性RNA酶保護而免于降解[10]，具有較好的穩定性和特異性，能穩定存在于血清、唾液及尿液等體液中[11]。通過現代技術可在體液中檢測到病理狀態下異常表達的miRNA，這使得外周血miRNA成為潛在的無創性診斷、治療及預后評估的新型分子生物學標志物。目前，血清miRNA-214已被證實可作為乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等的特異性腫瘤標志物而應用于臨床[12]。

關于miRNA-214在惡性腫瘤中的表達水平，近年來有大量的研究。Wang等[13]研究發現，miRNA-214在肝癌組織中表達下調，認為miRNA-214在肝癌的發生、發展、侵襲及轉移過程中起重要作用。Schwarzenbach等[14]研究報道，乳腺癌患者的外周血miRNA-214表達水平上調，miRNA-214在評價惡性指標及淋巴結轉移擴散方面具有重要作用。Yang等[15]研究顯示，miRNA-214在胃癌組織及細胞中均高表達，并證明miRNA-214通過綁定PTEN的3’UTR靶點，負性調控基因轉錄后水平，從而調節胃癌細胞的擴散、遷移和侵襲。另有研究表明，miRNA-214在食管癌中的表達下調，miRNA-214高表達能抑制食管癌細胞的增殖、轉移及凋亡，敲除miRNA-214后可促進腫瘤的發生及發展，并由此認為miRNA-214是食管癌的抑癌基因[16]。

本研究通過qRT-PCR檢測PTC及良性甲狀腺腫瘤患者的血清miRNA-214表達水平，結果發現，PTC患者的血清miRNA-214表達水平明顯高于良性甲狀腺腫瘤患者（P﹤0.01），ROC曲線分析證實miRNA-214可作為區分PTC與良性甲狀腺腫瘤的潛在分子標志物，對診斷PTC具有一定的臨床價值。本研究還發現，miRNA-214表達水平與PTC患者的腫瘤最大徑、被膜侵犯情況、淋巴結轉移情況及TNM分期有關，即腫瘤越大、存在被膜侵犯及淋巴結轉移、TNM分期越晚，miRNA-214表達水平越高，提示miRNA-214在PTC的發生、發展、侵襲及轉移過程中發揮重要作用。關于其他miRNA家族成員在PTC中的表達，Lee等[17]研究報道，PTC患者血漿中miRNA-155的表達較甲狀腺良性結節患者或健康人群明顯上調，其表達水平與PTC的侵襲性及預后不良有關。Yang等[18]研究顯示，miRNA-222-3p在PTC組織中表達升高，且其表達量與存在被膜侵犯、TNM分期晚、存在淋巴結轉移等病理因素密切相關，并認為miRNA-222-3p表達異常是PTC發生、發展、侵襲及轉移的重要因素。因此，miRNA-214可作為輔助診斷PTC的新的生物學標志物，并可用于術前臨床評估，通過調節miRNA-214的表達可以抑制腫瘤的侵襲及轉移，為腫瘤治療提供了新思路。

盡管PTC在生物學行為上表現為高分化惰性腫瘤，具有相對較弱的侵襲性和轉移性，腫瘤進展慢，病死率低，但PTC常發生淋巴結轉移，且早期發生頸部淋巴結轉移的可能性較大，從而表現出高侵襲性，影響預后。因此，術前了解PTC的侵襲性等病理學特征對指導術式、術后治療及預后評估十分重要。在miRNA與PTC生物學行為關系的研究中，Yip等[19]認為，在合并局部復發或遠處轉移的侵襲性PTC患者中，miRNA-222-3p和miRNA-146b-3p的表達水平較非侵襲性PTC患者明顯上調；另外一項研究也顯示，miRNA-221-3p、miRNA-222-3p和miRNA-146b-3p在伴有被膜侵犯的PTC組織中高表達[20]。其他研究則認為，血清miRNA-222-3p、miRNA-146b-3p、miRNA-221-3p和miRNA-222-3p在合并有淋巴結轉移的PTC患者中表達水平更高[17,21]。本研究結果顯示，血清miRNA-214表達水平與淋巴結轉移情況及被膜侵犯情況有關，且ROC曲線表明，miRNA-214在評價PTC是否合并淋巴結轉移或被膜侵犯方面具有診斷價值，說明術前檢測miRNA-214表達水平能預測PTC的某些病理特征及生物學行為，對術前PTC患者的個體化病情評估具有重要的指導意義。

綜上所述，miRNA-214在PTC患者的血清中表達上調，其表達水平能反映PTC的進展情況，可作為術前評估PTC淋巴結轉移及被膜侵犯情況的一項輔助指標，并對PTC的臨床診斷具有一定價值。筆者后續將研究miRNA-214在PTC組織中的表達水平，以探究miRNA-214在PTC發生、發展、侵襲及轉移中的具體作用機制，為miRNA-214作為新的診斷、治療及預后評估指標提供依據。

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